親和層析法分離純化油茶籽多糖Ⅰ的研究

王海林 王春艷 謝長林 文 漢

(安徽農業大學生命科學學院，合肥 230036)

親和層析法分離純化油茶籽多糖Ⅰ的研究

王海林 王春艷 謝長林 文 漢

(安徽農業大學生命科學學院，合肥 230036)

根據油茶籽多糖Ⅰ所擁有的特異性磷酸基團，運用固化金屬離子親和層析法獲得合適的金屬螯合劑，使得具有一定降血脂作用的油茶籽多糖Ⅰ能特異性的被結合到瓊脂糖凝膠上，從而獲得純度較高的油茶籽多糖Ⅰ。通過試驗對親和層析法在提取過程中的使用條件進行優化，得到最適pH以及離子類型。此外，試驗將傳統方法與親和層析法進行比較，其對油茶籽多糖Ⅰ的純化效果，尤其在去蛋白方面，后者能更有效地去除油茶籽多糖Ⅰ里殘留的蛋白質。

油茶籽多糖Ⅰ 親和層析 金屬離子螯合

植物多糖，又稱植物多聚糖，按其在植物體內的功能可分為兩類:一是形成植物的支持組織，如纖維素;二是植物的貯存養料，可溶于熱水成為膠體溶液，也可借酶水解后釋放單糖以供應能量，如淀粉、菊糖等。多糖是一種具有多種生物活性的大分子，不僅是生物的營養成分，也是一種重要的信息或信息分子的受體，參與分子識別、細胞粘著及細胞的防御作用，具有能量儲存、結構支持、防御和抗原決定性等功能。隨著對傳統中藥的不斷研究，從20世紀70年代開始，陸續有一批活性多糖成分被發現。在研究其功效的過程中，人們驚喜地發現:多糖作為一種幾乎無毒副作用的天然提取物，在免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等諸多方面都有著獨特的功效［1－2］。多糖的研究已經引起國內外廣大藥物研究開發者的重視，相關研究報告逐年遞增。我國目前對生物多糖的研究大部分集中在人參、銀耳、黑木耳、刺參和黃芪等名貴中藥材［3］，而對于山茶科的植物，尤其是油茶籽多糖的報道則少之甚少［4］。在研究過程中發現，油茶籽多糖Ⅰ具有降血脂和降血糖的雙重作用，但在分離的過程中很難得到高純度的油茶籽多糖Ⅰ。此外，還發現油茶籽多糖Ⅰ具有特異性的磷酸基團(圖1、圖2)，多糖Ⅰ的曲線與磷酸鹽的曲線匹配度很高，因而可以考慮根據油茶籽多糖Ⅰ的特異性磷酸基團，在分離純化時用親和層析法。

油茶主要用于榨取茶籽油，而分析榨油后的茶籽餅，其主要成分除含有殘留茶油7．45%外，還有茶皂素約 12．8%～13．8%，總糖44．50%(包括淀粉)和濃縮的粗蛋白質約15．94%。因此，對以往大多廢棄的茶籽餅進行進一步的研究開發具有重要的意義。以前試驗所用的方法雖然能分離出油茶籽多糖Ⅰ，但無法在短時間內獲得高純度的產物，并且傳統的Sevage法并不能很理想地將所提取多糖中的蛋白質雜質去除干凈，而本實驗室通過親和層析的第一步就能達到比較理想的純化效果，并且簡單易行。為了更好地用更短的時間獲得高純度的油茶籽多糖Ⅰ，本試驗研究探索用親和層析法分離純化產物，以更大地發揮其藥用價值。

圖2 磷酸鹽標準圖

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗所用到的油茶籽多糖均由安徽農業大學生物化學實驗室提供。

MC99－3自動液相色譜分離層析儀:上海滬西分析儀器廠有限公司;722S分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;TU1810型紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司;旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠;真空冷凍干燥機:北京德天佑科技發展有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 粗多糖溶液的處理［5－9］及層析樣品的準備

取粗提的油茶籽多糖加水溶解，因粗提物含有大量色素，故要通過DE－52進行層析處理，以避免色素等雜質對多糖溶液在親和層析過程中的干擾。以此處理好的粗多糖溶液即為層析的樣品。

1．2．2 標準曲線的制作

分別準確吸取葡萄糖標準液(0．1 mg/mL)0、0．05、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mL 于 5 mL 試管中，加水至5 mL，加入蒽酮試劑2．5 mL充分混勻，在沸水浴中加熱10 min后取出，流水中冷卻20 min后在620 nm波長下，以空白試劑調零，測各管的吸收值繪制標準曲線。

以葡萄糖(Glucose，GLU)與蒽酮反應后的物質在波長為620 nm下所得的吸光值為縱坐標，以葡萄糖的體積為橫坐標，作標準濃度葡萄糖曲線(圖3)。由圖3可知，其回歸方程為 y=0．013 6x+0．019 7，R2=0．994 8，式中:y 為 OD620nm，x 為葡萄糖加樣量/μg。

圖3 葡萄糖標準曲線

1．2．3 親和層析柱的改裝［10］

本試驗采用鎳離子親和層析柱進行初步試驗，目的是為了找出最佳的金屬離子，以增加親和層析過程中凝膠對目標多糖的吸附量。試驗過程中首先用鎳離子親和層析柱處理樣品，試驗后需更換金屬離子，綜合考慮用 Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+進行初步試驗。在幾種金屬離子的轉換過程中，首先將鎳離子親和層析柱用5倍柱體積的EDTA－Na2溶液將其中的金屬離子去除，接著用3倍柱體積的蒸餾水對已去除金屬離子的凝膠進行清洗，清洗完畢之后則用欲添加的金屬離子的鹽溶液(5倍柱體積)進行洗柱，使其中的目標金屬離子有效地結合到瓊脂糖凝膠上，最后再用5倍柱體積的蒸餾水對已更換金屬離子的瓊脂糖凝膠進行清洗，此即將親和層析柱改裝完畢。

1．2．4 金屬離子螯合后的層析

分別取5 mL已處理過的粗多糖溶液上柱，待柱子平衡后，先用300 mL的蒸餾水進行洗脫，收集洗脫液并濃縮至5 mL;接著再用200 mL磷酸鹽緩沖液進行洗脫，并濃縮至5 mL。保留各種親和層析柱的洗脫液，并在620 nm處測量其OD值。然后利用標準曲線計算出每種金屬離子的多糖結合量進行比較。

1．2．5 洗脫時pH和離子濃度的影響

由前一步驟可以篩選出與油茶籽多糖Ⅰ親和力最好的金屬離子，選定金屬離子后進行單因素的洗脫條件優化，分別用不同pH的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，得到最佳離子洗脫劑的最適pH。確定最適pH后再進行離子濃度的試驗，以此在最適pH的前提下確定最經濟的離子濃度。

2 結果與分析

2．1 粗多糖的預處理

使用DE－52陰離子交換柱，用500 mL的NaCl(3 mol/L)溶液對去離子水進行梯度洗脫后，以每1 mL樣品滴加5 mL蒽酮試劑(0．1 g蒽酮+50 mL 80%硫酸)進行比色。以在波長為620 nm下所得的吸光值為縱坐標，管號為橫坐標，作出粗多糖洗脫時多糖的分布情況(圖4)。

由圖4可知，經過DE－52(DEAE－纖維素)柱用500 mL的NaCl(3 mol/L)溶液對去離子水進行梯度洗脫后，目標多糖能夠較好地被集中收集，從而達到預處理的目的，盡量減少雜質(如色素)以及一些蛋白質在親和層析時的影響，以提高試驗效率，并為后面的分離純化提供相對較純凈的多糖樣品。

圖4 粗多糖過DE－52柱的洗脫情況

2．2 親和層析檢出物質的分析

2．2．1 水洗瓊脂糖凝膠時蛋白的洗脫

水洗瓊脂糖凝膠時，以靈敏度為0．1 A進行紫外檢測，以其OD260值為縱坐標，管號為橫坐標作圖(圖5)。

圖5 水洗瓊脂糖凝膠時蛋白的洗脫分布

由圖5可知，在水洗瓊脂糖凝膠時，由于蛋白無法與瓊脂糖凝膠螯合，所以水洗時被較快地洗脫下來。由此可知，大多數無法與瓊脂糖凝膠結合的物質都會被較快地洗脫下來，從而能夠很好地分離目標多糖，減少雜質的影響。

在多糖的分離純化過程中，去蛋白是相對關鍵的一步，傳統的Sevage法并不能很理想地將所提取多糖中的蛋白質雜質去除干凈，而本實驗室通過親和層析的第一步就能達到比較理想的純化效果，并且簡單易行。在該洗脫過程中，洗脫劑是蒸餾水，并不會在目標多糖中引入不必要的雜質。

2．2．2 水洗瓊脂糖凝膠時的非目標多糖的洗脫

水洗瓊脂糖凝膠后，以每0．5 mL樣品滴加2．5 mL蒽酮試劑(0．1 g蒽酮+50 mL 80%硫酸)進行比色。以在波長為620 nm下所得的吸光值為縱坐標，管號為橫坐標，作出水洗時非目標多糖的分布情況(圖6)。

圖6 磷酸緩沖液洗瓊脂糖凝膠的非目標多糖

由圖6可知，在水洗瓊脂糖時，非目標多糖因不能與瓊脂糖螯合，一開始就被大量地洗脫下來，從而能夠很好地純化目標多糖。在圖6的主峰中，可看到其最大OD值已達近0．5，說明此步驟中很多不能與瓊脂糖凝膠結合的多糖被洗脫下來。由于柱體積相對較小，其本身能結合的油茶籽多糖Ⅰ的能力有限，所以在該過程中可能有很多未跟瓊脂糖凝膠結合的油茶籽多糖Ⅰ也一同被洗脫下來。

2．3 金屬螯合劑的選擇

親和層析的關鍵是對金屬螯合劑的選擇，試驗分別研究了 Ni2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+等金屬離子的洗脫效果。表1～表3中每種柱子的柱體積皆為25 mL，上樣量皆為5 mL，上樣的多糖質量濃度大約為0．6 mg/mL，洗脫劑皆為pH 6．0的磷酸鹽緩沖液(0．2 mol/L)。由表1可明顯看出各種不同金屬離子對油茶籽多糖Ⅰ的吸附效果各有不同，而其中以Cu2+效果最佳。雖然Fe3+與其他離子相比也有一定效果，但在具體試驗過程中發現，Fe3+能使瓊脂糖凝膠變成紫色(可能是其與凝膠的某些基團反應)，從而污染了試驗材料，使凝膠的重復利用受到影響，故本試驗選擇的最為理想的金屬離子是Cu2+。而由表2、表3也可以明顯看出處理3的1%水平跟其余幾組差異極顯著，故Cu2+為最佳選擇。

表1 不同金屬離子的洗脫結果

表2 方差分析

表3 差異顯著水平

由圖3和表1，可以計算得出各種離子親和層析柱(25 mL柱體積)的多糖吸附量(表4)。運用各種離子進行親和層析時，在其他因素相同的情況下，Cu2+對多糖的吸附效果最好。Fe3+對多糖的吸附效果雖較好，但其與瓊脂糖凝膠結合后沒有很好的方法被洗脫下來，不能再次利用，因此不作考慮。其他離子吸附量相對太小，因此最后確定用Cu2+進行親和層析。

表4 各種親和層析柱的吸附量

2．4 pH和離子濃度的影響

2．4．1 pH 的影響

運用磷酸鹽緩沖液(0．2 mol/L)進行洗脫時，根據磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合的比例不同而調節pH，用不同pH的磷酸鹽緩沖液對水洗后的瓊脂糖凝膠進行洗脫，以此確定最適宜的洗脫pH。以pH的大小為橫坐標，OD620為縱坐標，作圖7。

圖7 水洗瓊脂糖柱時pH的影響

由圖7可知，運用磷酸鹽緩沖液(0．2 mol/L)調節出的不同pH中，雖然每種pH的磷酸鹽緩沖液都可以洗脫下目標多糖，但明顯pH為6．0時的洗脫能力最好，以此確定用pH為6．0的緩沖液進行洗脫。由表5、表6的分析結果也能進一步確定pH 6．0是最佳的pH洗脫條件。

表5 方差分析

表6 差異顯著水平

2．4．2 離子濃度的影響

用磷酸鹽緩沖液時，在相同的pH條件下還要考慮離子濃度的影響，即磷酸鹽緩沖液在配制時使用不同的濃度，在0．2 mol/L的基礎上，又使用了濃度為1/15 mol/L的磷酸鹽緩沖液，以此進行比較，試驗結果如表7。

表7 離子濃度的洗脫比較

由表7可知，濃度為0．2 mol/L的磷酸鹽緩沖液的洗脫能力比濃度為1/15 mol/L的磷酸鹽緩沖液的洗脫能力要強，因此選擇濃度為0．2 mol/L的磷酸鹽緩沖液進行洗脫。

3 討論

水洗瓊脂糖凝膠后，再用磷酸鹽緩沖液洗脫，以此分離多糖Ⅰ，根據以上分析可以看出，在此洗脫過程中可以很好地去除粗提時沒有除去的蛋白質等其他雜質，并可將其他多糖很好地分離開，得到相對較純的多糖Ⅰ，以此達到試驗目的。

水洗不同金屬離子的瓊脂糖凝膠時，在考慮可行性、經濟性后，初步確定用Cu2+進行螯合，磷酸鹽緩沖液洗脫時初步確定用pH 6．0、濃度為0．2 mol/L的洗脫液。

在使用固化金屬離子親和層析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)時，Fe3+分離的效果也很明顯，但其在使用時沒有很好的方法從瓊脂糖凝膠上被洗脫下來，因此，沒有考慮用其進行螯合固化洗脫。

在確定用Cu2+后，再進一步試驗何種濃度的磷酸鹽緩沖液比較適宜對Cu2+進行洗脫，因此又用濃度為1/15 mol/L的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，以此比較，最后選擇 0．2 mol/L。

4 結論

4．1 在粗多糖的預處理中使用DEAE－纖維素層析，效果明顯，可以去除粗提物中含有的大量色素以及其他物質。

4．2 親和層析法在油茶籽多糖分離中作用效果明顯，尤其以Cu2+進行洗脫時效果相對最佳。

4．3 在親和層析時使用pH 6．0、濃度為0．2 mol/L的磷酸鹽緩沖液進行洗脫時效果相對適宜。

4．4 試驗目標多糖Ⅰ雖然得到了很好的分離，但仍無法排除有其他多糖的可能性，仍需探索使其獲得更高的純度。

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Study of Affinity Chromatography Used in the Separation and Purification of the Oil of Tea Seed PolysaccharideⅠ

Wang Hailin Wang Chunyan Xie Changlin Wen Han

(School of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei230036)

The experiment was based on specific phosphate groups of oil tea seed polysaccharideⅠ，the use of solidifying metal ion affinity chromatography to obtain a suitable metal chelating agents，so that the oil a lipid－lowering effect of tea seed polysaccharideⅠ can be integrated into specific agar glucose gel，to obtain high purity of the oil tea seed polysaccharideⅠ．Through the experiments，the affinity chromatography method in the extraction process of the conditions of use was optimized，getting the optimal pH and ion type．In addition，the experiment compared the traditional method with the affinity chromatography method，the purification effect of oil tea seed polysaccharideⅠ，especially in the protein removing，the latter can more effectively remove the residual protein in oil tea seed polysaccharideⅠ．

oil tea seed polysaccharide，metal chelating，affinity chromatography

Q503

A

1003－0174(2012)11－0034－05

2012－02－09

王海林，男，1985年出生，碩士，天然產物與次生代謝

文漢，男，1963年出生，副教授，天然產物與次生代謝