荔枝干微生物菌落分析及其霉菌的分離鑒定

楊韋杰，徐玉娟，唐道邦，吳繼軍，肖更生，*

（1.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌330045；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

荔枝干微生物菌落分析及其霉菌的分離鑒定

楊韋杰1，2，徐玉娟2，唐道邦2，吳繼軍2，肖更生2，*

（1.江西農業大學生物科學與工程學院，江西南昌330045；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

為了研究荔枝干貯藏銷售期內普遍存在的微生物超標及霉變問題，對市場零售的散裝荔枝干樣品進行了微生物數量的測定，并對散裝和真空包裝的荔枝干樣品中的霉菌進行了分離、純化、鑒定。結果表明：20%樣品菌落總數＞750cfu/g，80%樣品霉菌總數＞50cfu/g，抽樣合格率為20%；從荔枝干樣品中分離得到5株霉菌，通過形態學觀察鑒定為黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉、紅曲霉和黑綠青霉，并確定曲霉屬菌株為荔枝干表面霉菌的優勢菌群。

荔枝干，霉變，霉菌，鑒定

荔枝（Litchi Chinensis Sonn）是我國華南地區的大宗特色水果，果實風味獨特，營養豐富。由于其成熟于盛夏季節、產期集中和不耐貯藏運輸等特點，新鮮荔枝如不及時銷售，短期內就會失去經濟價值。荔枝干加工對新鮮原料處理量大，同時可以延長果實貨架期、降低儲運成本，是解決季節性供需矛盾的有效途徑，現已成為荔枝加工的主要形式，占加工總量的80%以上[1]。荔枝干加工多采用日曬法、火焙法和熱風干燥法，加工工藝粗放，技術水平參差不齊，品質差異很大。成品一般不經過后殺菌技術，包裝方式簡陋。因此，荔枝干在貯存銷售過程中存在發霉、微生物指標超標等風險，這不但給生產者和中間商帶來經濟損失，更重要的是對消費者身體健康構成潛在威脅[2]。目前，學者們對荔枝干制加工過程的研究主要集中在干燥加工工藝和理化性質變化方面，對荔枝干食品安全控制研究較少。本文從微生物學角度，通過荔枝干霉變微生物的分離鑒定，研究荔枝干霉腐微生物的優勢菌群和種類，以期獲得荔枝干貯藏銷售過程中控制霉變，保證其安全衛生的有效途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

實驗共采集8份荔枝干（整果）樣品 1～5號樣品購自廣東廣州市天平架水果交易市場，包裝方式散裝，6～8號樣品采自廣東惠州市四季鮮綠色食品有限公司，已出現霉變特征，包裝方式真空包裝；細菌、放線菌、酵母和霉菌計數培養基 分別采用營養瓊脂培養基（NA）、高氏一號培養基、麥氏培養基和孟加拉紅培養基；分離、純化真菌用培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）；鑒定用培養基 察氏瓊脂培養基（CA），以上培養基均121℃滅菌20min備用，配制方法見文獻[3]；乳酸苯酚棉蘭固定液 苯酚10g，乳酸10g，甘油20g，棉蘭0.05g，蒸餾水10mL，將苯酚置于水浴中加熱至結晶溶解，然后加入乳酸、甘油和棉蘭[4]，以上試劑均為國產分析純。

DMLB2顯微鏡 德國LEICA公司；ALC-210.4電子天平 德國ACCULAB公司；SW-CJ-1F垂直凈化工作臺 上海陽光實驗儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養箱 上海博訊實業有限公司；其他為常規實驗儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 荔枝干表面微生物的菌落計數 稱取25g完整無破殼荔枝干樣品（約5粒）置于盛有225mL無菌生理鹽水的帶玻璃珠錐形瓶中，振蕩搖勻，制成1∶10的樣品勻液，按常規方法進行平板稀釋分離，細菌于37℃倒置培養2d，放線菌、霉菌和酵母于28℃倒置培養4～7d，計數觀察。

1.2.2 霉菌分離純化 采用平板劃線分離法。無菌條件下，挑取霉菌單菌落劃線于PDA平皿上，于28℃倒置培養4～6d，待菌種純化后用于形態觀察接種。若菌落菌體不純，含有雜菌時，可重新劃線分離，直至菌體純化為止。

1.2.3 菌種鑒定培養 采用標準培養條件培養菌種，用于形態觀察。無菌條件下，用接種針挑取純化分離平皿中的單菌落孢子，對稱3點接種于倒置拿取的CA平皿，接種時應避免孢子散落于平皿其他位置[5]。于25℃倒置培養7d后進行菌種鑒定，鑒定方法依照參考文獻[6-9]。

1.2.4 菌落形態觀察 用肉眼直接觀察平皿上的菌落大小、顏色、質地、滲出物等形態特征。

1.2.5 顯微形態觀察 使用載片培養法[7]觀察菌絲體分支、子實體著生狀態和分生孢子頭的大致情況；使用插片培養法[10]觀察青霉帚狀枝分支狀況；使用乳酸苯酚棉蘭固定液制成的臨時裝片，觀察霉菌各器官的細節。

2 結果與分析

2.1 荔枝干樣品中主要微生物及其數量

通過平板稀釋分離，對1～5號荔枝干樣品中的細菌、放線菌、酵母和霉菌的數量進行了測定，結果見表1。5個樣品中，細菌數占微生物總數的21.43%～61.54%，酵母菌數占微生物總數的20.00%～53.57%，霉菌數占微生物總數的5.77%～26.07%。所有樣品均未分離到放線菌，可能是由于荔枝干果殼表面營養物質和較低的水分活度不適合放線菌的生長。

由荔枝干表面各微生物檢測結果分析，各類菌群的檢測值都較低，但樣品總合格率僅為20%。荔枝干標準NY/T 709-2003中規定：成品荔枝干菌落總數≤750cfu/g，霉菌數≤50cfu/g。隨著貯藏期的延長，1～5號樣品中除5號樣品微生物總數超標外，其他樣品菌落總數均在標準規定范圍內；只有2號樣品的霉菌數量在標準規定范圍內，其余樣品均超標，可見荔枝干霉菌數量超標是其微生物菌落總數超標的重要原因。

表1 荔枝干樣品表面微生物的種類及數量Table 1 Species and amount of microbes on the surface of dried litchi

2.2 樣品中霉菌種類特征

1～8號荔枝干樣品霉菌種類特征的分析可知8個樣品中分離到的霉菌有曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和紅曲霉屬（Monascus）共3個屬，結果見表2。其中曲霉屬在8個樣品中均分離得到，檢出率為100%，說明曲霉屬的菌株為荔枝干表面霉菌的優勢菌群。6～8號樣品采自真空包裝后，具霉變特征的荔枝干樣品，結果更具代表性。曲霉屬真菌是自然界分布最普遍的腐生菌之一。多種曲霉與谷物、食品、飼料、藥材、煙草等商品的劣化有密切關系，在濕熱條件下尤為嚴重。

表2 荔枝干樣品中所含霉菌種類Table 2 Genus of mould on the surface of dried litchi

2.3 樣品中霉變真菌的鑒定

從8個樣品中共分離純化出5株霉菌，分別編號為L1、L2、L3、L4和L5，鑒定結果如下：

L1菌株：菌落在CA培養基上生長較快，25℃培養7d，直徑38～45mm；質地絲絨狀，中央部分絮狀；分生孢子結構大量，初為淡黃色，漸變為黃綠色，老后色澤變暗，反面無色或稍帶褐色；菌落平坦，具不明顯放射狀皺紋；分生孢子頭幼為球形，后呈疏松放射狀。分生孢子梗生于基質，粗糙；頂囊近球形或燒瓶形，大部分表面可育，極少者僅上部可育；小梗雙層，偶見單層；分生孢子球形，光滑。該菌株鑒定為：半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、曲霉屬、黃曲霉群，形態特征如圖1和圖2所示。

圖1 L1菌株菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strains L1

圖2 L1菌株分生孢子頭形態（640×）Fig.2 Conidial head structure of strains L1（640×）

L2菌株：菌落在CA培養基上生長迅速，25℃培養7d，直徑55～60mm；質地呈致密絲絨狀；分生孢子結構大量，呈黑色或炭黑色，反面無色或淡黃色；菌落平坦，具規則放射狀溝紋；滲出液少量，無色；分生孢子頭幼時球形，老后呈輻射狀；分生孢子梗生于基質，平滑；頂囊球形，全部表面可育，小梗雙層；分生孢子球形，壁粗糙具突起。該菌株鑒定為：半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、曲霉屬、黑曲霉群，形態特征如圖3和圖4所示。

圖3 L2菌株菌落形態Fig.3 Colonial morphology of strains L2

圖4 L2菌株分生孢子頭形態（640×）Fig.4 Conidial head structure of strains L2（640×）

L3菌株：菌落在CA培養基上生長迅速，25℃培養7d，直徑50～55mm；質地絲絨狀兼有少量絮狀；分生孢子結構較少，淺灰綠色，老后顏色加深，反面無色或淺綠色；菌落平坦，滲出液少量，無色；具輕霉味；分生孢子頭呈短柱狀；分生孢子梗生于基質；頂囊燒瓶形，全部表面部分可育，小梗單層；分生孢子近球形，粗糙。該菌株鑒定為：半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、曲霉屬、煙曲霉群，形態特征如圖5和圖6所示。

圖5 L3菌株菌落形態Fig.5 Colonial morphology of strains L3

圖6 L3菌株分生孢子頭形態（640×）Fig.6 Conidial head structure of strains L3（640×）

L4菌株：菌落在察氏瓊脂培養基（CA）生長較慢，25℃培養7d，直徑15～18mm；質地絮狀；菌絲初為白色，老后轉為褐色，反面紅褐色，偶有鮮紅色色素；氣生菌絲生于基質，與培養基結合較緊密。菌絲有隔，分支繁雜，多核，規律性縊縮，出現菌絲節；無明顯分化的分生孢子梗；分生孢子串生，3～9個成鏈，球形或梨形；閉囊殼球形，無孔口，子囊球形。該菌株鑒定為：真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科、紅曲霉屬，形態特征如圖7和圖8所示。

圖7 L4菌株菌落形態Fig.7 Colonial morphology of strains L4

圖8 L4菌株分生孢子形態（400×）Fig.8 Conidium morphology of strains L4（400×）

L5菌株：菌落在CA培養基上25℃培養7d，直徑26～28mm；質地絨狀；分生孢子結構大量產生，分生孢子面中央部分暗綠色，邊緣藍綠色，反面棕褐色；菌落平坦，中間有臍狀突起，幼時菌落外延可見同心環紋，老后不明顯；菌絲體白色，無滲出液；分生孢子梗生于基質，與培養基結合不緊密；菌絲有隔；帚狀枝三輪生，緊密；瓶梗呈瓶狀至披針形；分生孢子近球形，光滑。該菌株鑒定為：半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、青霉亞屬、擴展青霉系、黑綠青霉，形態特征如圖9和圖10所示。

圖9 L5菌株菌落形態Fig.9 Colonial morphology of strains L5

圖10 L5菌株帚狀枝形態（640×）Fig.10 Penicillus morphology of strains L5（640×）

3 結論與討論

荔枝干表面各類微生物的菌落計數結果表明，市場上銷售的散裝荔枝干衛生狀況較差。80%樣品的霉菌總數＞50cfu/g，少數未達標產品的霉菌總數為標準規定范圍的5.6倍（2.8×102cfu/g），污染嚴重；通過對荔枝干表面霉菌的分離、培養和鑒定，發現黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉、紅曲霉和黑綠青霉等多種霉菌可能與荔枝干貯藏銷售期產生的霉變損失有關，其中曲霉屬菌株是引起荔枝干霉變的優勢菌群。由于曲霉屬不少菌株具有適高溫和高滲透壓的特性，這種特性可能是其能夠適應荔枝干果殼表面干燥環境，并成為霉菌優勢菌群的一個重要原因[11-12]。

成品荔枝干的水分含量≤25%，含糖量高、水分活度（Aw）較低，不適合多數微生物的生長[13]，但由于荔枝干成品缺乏科學有效的后殺菌技術和簡陋的貯藏條件，再加上荔枝干加工多集中于廣東、廣西、福建等氣候濕潤、年平均氣溫較高的省份。隨著貯藏期的延長，成品緩慢吸水致水分含量逐漸升高，擠壓碰撞導致的破殼果數量不斷上升，使得霉變的風險不斷加大。個別處理不當的情況下，荔枝干經過3～4個月的時間可有60%以上有蟲害或發霉現象[14]。

市場上荔枝干成品包裝多采用散裝形式，產品直接與空氣接觸，貯藏銷售過程中由美拉德反應引起的非酶褐變導致果皮、果肉顏色不斷加深，這些不但造成氨基酸、糖類等營養物質的損失，而且使得產品的競爭力和消費者的購買欲下降。真空包裝的荔枝干雖然在一定程度上解決了成品色澤加深的問題，但有學者研究表明，采用真空包裝的荔枝干產品的保存期較短[15]。本實驗部分霉菌分離自真空包裝內發生霉變的荔枝干，也證明了上述說法的合理性。這可能是由于真空包裝不能做到絕對真空，包裝內的氧氣含量導致部分好氧性微生物無法生長，破壞了原本微生物群落各菌群間的拮抗作用，使得少數適應性較強的霉菌逐漸繁殖，導致霉變的發生。

隨著社會的發展，消費者對健康的要求越來越高，對產品的質量要求日益嚴格，荔枝干加工產業的科技化投入需不斷加強。首先應從高效合理的干燥技術和工藝研究入手，并將HACCP引入荔枝干生產，以提高產品的質量和安全；其次應探求科學合理的殺菌技術、貯藏條件和包裝技術手段，進一步提高產品的質量檔次。

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Analysis of microorganism colonies and isolation，identification of microorganism causing mold damage from dried litchi

YANG Wei-jie1，2，XU Yu-juan2，TANG Dao-bang2，WU Ji-jun2，XIAO Geng-sheng2，*
（1.College of Bioscienceamp;Bioengineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Guangdong Key Laboratory of Agricultural Product Processing，Sericulture and Farm Product Processing Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，China）

In order to study the microbiological control and mold damage of dried litchi in storage period，the colony counts of microorganism from dried litchi sample in bulk and the fungi causing mold damage from vacuum and bulk packaging of sample were analyzed.The result indicated that total microbial count of 20% sample was greater than 750cfu/g，total fungi count of 80%sample was greater than 50cfu/g，and the eligibility rate was 20%.Five strains of mould include Aspergillus flavus，A.niger，A.fumigatus，Monascus and Penicillium atramentosum were separated and purified from vacuum and bulk packaging of dried litchi and the dominate microorganism of mould were identified as Aspergillus.

dried litchi；mildew；mould；identification

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0152-04

2011－05－16 *通訊聯系人

楊韋杰（1985-），男，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

廣東省科技計劃項目（2009A020101002）；廣東省科技計劃項目（2010B080100026）；廣東省現代農業產業技術體系建設專項。