水酶法提取油菜籽粕中多酚的研究

肖 頔 王承明

(華中農業大學食品科技學院，武漢 430070)

水酶法提取油菜籽粕中多酚的研究

肖 頔 王承明

(華中農業大學食品科技學院，武漢 430070)

采用水酶法和響應面設計法對菜餅粕中多酚的提取工藝進行研究。在單因素試驗的基礎上，選定pH、加酶量、溫度和反應時間4個因素，通過響應面分析得到了優化組合條件。最佳工藝條件是:原料粒度80 目，液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量4.3%，溫度 50 ℃，時間 43 min，此時菜籽多酚得率為 6.43 mg/g。

菜籽粕 多酚 提取 水酶法 響應曲面法

油菜籽是世界三大油料作物之一。我國是世界上油菜籽產量最多的國家，近年來的年產量已達到1 000萬噸，提取菜籽油后，每年大約有650萬噸菜籽餅粕產生［1－3］。菜籽餅粕中蛋白質含量很高，約為45%，但其中含有硫代葡萄糖苷、植酸、多酚化合物等有害及抗營養成分，因而無法作為食品級蛋白質，限制了菜籽餅粕的開發和利用［4］。大量的菜籽餅粕只能按少量比例添加到動物飼料中或用作肥料，造成了資源的極大浪費。從菜籽餅粕中把抗營養成分提取出來，具有提高菜籽餅粕使用價值和增加其附加值的重要意義。

菜籽多酚是存在于菜籽餅粕中的一類植物次生代謝產物［5］。而且菜籽粕中多酚含量高于其他油料粕，大約是大豆粕30倍［6］。目前，從菜籽餅粕中提取菜籽多酚，國內有關報道主要是采用甲醇、丙酮、乙醇等有機溶劑提取，但由于環境污染和成本等原因，這些方法不太適合工業上的應用。酶提取技術是近幾年發展起來的一項重要的提取技術，通過酶反應溫和地將植物組織分解，可以加速有效成分的釋放和提取［7］。利用水酶法提取菜籽粕中多酚少有報道，本試驗著重研究利用糖化酶提取菜籽餅粕中菜籽多酚的各個影響因素，并對其進行了工藝優化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油菜籽粕:由益海嘉里(武漢)糧油工業有限公司提供;糖化酶:北京奧博星生物技術有限責任公司;一水合沒食子酸標樣:國藥集團化學試劑有限公司;鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸、鹽酸、碳酸鈉和溴水為分析純。

1.2 主要儀器

電子天平:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;余佳水浴鍋:浙江省余姚市檢測儀表廠;pH計:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;722型分光光度計:天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽粕多酚含量的測定

采用 Folin－Ciolcallteu比色法［8］。

1.3.1.1 一水合沒食子酸標準溶液

準確稱取一水合沒食子酸0.100 g，用蒸餾水溶解、定容至100 mL，此溶液質量濃度為1 000 mg/L。分別吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 到 100 mL 的瓶中，用水稀釋定容。即分別得到 0、10、20、30、40、50 μg/mL的一水合沒食子酸標準溶液。

1.3.1.2 標準曲線的制作

從 0、10、20、30、40、50 μg/mL 的一水合沒食子酸標準溶液中分別吸取1.0 mL，分別加水5 mL，FC顯色劑1.0 mL，7.5%碳酸鈉溶液3 mL，此時分別相當于得到 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL 的一水合沒食子酸。放置2 h后在765 nm下測定系列標準溶液的吸光度。以吸光度對沒食子酸濃度進行線性回歸分析，繪制標準曲線。

1.3.1.3 含量測定

將油菜籽粕多酚提取液加蒸餾水定容至100 mL，準確移取1.0 mL，按照“1.3.1.2”的方法處理樣品溶液，同樣測定A765，對照標準曲線計算得到多酚含量。

1.3.2 工藝流程

油菜籽粕→粉碎→過篩→水酶法提取→離心取上清→定容至100 mL→FC測定

1.3.3 單因素試驗設計

油菜籽粕機械粉碎后，過80目篩，準確稱取一定量的經過前處理的油菜籽粕，采用水酶法提取多酚，考察加酶量、反應時間、液料比(水:菜籽粕，mL/g)、pH、溫度對多酚得率的影響。

1.3.4 響應面的組合試驗設計［9］

在單因素試驗的基礎上，確定pH(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)、反應時間(X4)4個因素為自變量，多酚得率為響應值，通過響應面分析及嶺嵴分析對提取條件進行優化。試驗因素及水平選取見表1。

表1 水酶法提取菜籽粕多酚試驗的因素與水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線

標準曲線的回歸方程為:y=0.126 8x+0.012 2，r=0.999 3。式中，x為反應體系中沒食子酸含量(μg/mL)，y為反應后反應體系在765 nm下的吸光度。在0～5.0 μg/mL范圍內，沒食子酸含量與A765呈極顯著性正相關。

2.2 水酶法提取菜籽多酚單因素試驗

2.2.1 加酶量對多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在液料比 15∶1，溫度為 50℃，pH 4.0 的條件下，分別加入 1%、2% 、3% 、4% 、5%、6%糖化酶，提取時間40 min，然后離心取上清液并定容，用FC比色法測定多酚含量，結果如圖1所示。

圖1 加酶量對多酚得率的影響

從圖1中可以看出，隨著糖化酶用量的增加，多酚得率逐漸提高，酶用量達一定值后，多酚得率增加緩慢。這可能是由于底物中與酶相互作用的位點飽和，趨近于穩定，綜合考慮，選擇4%加酶量較合適。

2.2.2 反應時間對多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在液料比15∶1，溫度為50℃，pH 4.0，加酶量4%的條件下，提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚含量，結果如圖2所示。

圖2 反應時間對多酚得率的影響

由圖2可知，在一定的范圍內隨著提取時間的延長，得率得到提高，但在40 min后得率反而有所降低。其原因可能是在長時間高溫下菜籽多酚發生氧化、降解、縮合等反應，使得得率降低。因此提取時間選擇40 min為宜。

2.2.3 液料比對多酚得率的影響

稱取 1.00 g樣品，在溫度為 50 ℃，pH 4.0，加酶量4%，反應時間40 min的條件下，液料比分別為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 下提取，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結果如圖3所示。

圖3 液料比對多酚得率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增加，多酚得率隨之提高，但是到達了一定程度后得率反而會有降低的趨勢。這可能是因為隨著液料比的增大，多酚溶出增加，當液料比達到25∶1，多酚溶出基本平衡，而隨著液料比的進一步增加，溶液體積加大，加大了與空氣接觸面從而導致部分多酚被氧化，進而多酚得率有所下降，另外增加提取液會使提取成本加大，綜合考慮，液料比選取25∶1比較合理。

2.2.4 pH對多酚得率的影響

稱取1.00 g樣品，在溫度為50℃，液料比25∶1，加酶量4% 的條件下，分別調 pH 為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，提取 40 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結果如圖4所示。

圖4 pH對多酚得率的影響

由圖4可知，隨著pH的升高，多酚得率逐步增加，pH 5.0時多酚得率最高，為較優提取條件。

2.2.5 溫度對多酚得率的影響

稱取1.00 g 樣品，在液料比 20∶1，pH 5.0，加酶量4%的條件下，反應溫度分別為 40、45、50、55、60、65℃下提取40 min，離心取上清液，定容后測定菜籽多酚的含量，結果如圖5所示。

圖5 溫度對多酚得率的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，多酚得率逐漸升高，50℃后多酚的提取效果反而下降。這可能是因為溫度過高使得多酚氧化，酶的活性降低，進而引起得率下降，故選反應溫度為50℃。

2.3 響應面試驗結果與分析

響應面試驗設計及結果見表2。

表2 水酶法提取菜籽粕多酚的響應面組合設計及結果

利用Design－Expert對表2中的試驗數據進行回歸擬合，得到菜籽粕多酚得率對以上4個因素的回歸方程為:

Y=6.405+0.058X1+0.149X2+0.064X3+0.039X4－ 0.254X1X1+0.032X1X2+0.032X1X3－0.245X2X2+0.075X2X3－0.030X2X4－0.234X3X3+0.004X3X4－0.044X4X4

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著;模型的一次項X2極顯著，X1、X3顯著;X4不顯著，各因子顯著性順序為:加酶量(X2)＞溫度(X3)＞pH(X1)＞反應時間(X4);二次項 X21、X22、X23均極顯著;說明各因子對響應值(提取率)的影響不是簡單的線性關系。各試驗因子與響應面的關系中，其因變量和全體自變量之間的關系顯著，r=93.59%，說明響應值的變化有93.59%來源于所選變量，即pH、加酶量、溫度、反應時間。失擬項不顯著，說明擬合程度較好。整體分析來看，回歸模型的擬合程度較好，可以用上述回歸方程對糖化酶提取菜籽粕多酚的試驗加過進行分析預測和確定最佳提取工藝條件。

表3 回歸模型方差分析

由表4中可以看出，4個因素的特征值都為負，表明有極值。由SAS軟件分析，得出各因素最優水平組合為:X1=0.146 3，X2=0.321 2，X3=0.201 5，X4=0.341 5，Y=6.446 0，即 pH 5.07，加酶量4.32%，溫度 50.10 ℃，反應時間 43.41 min，考慮實際情況，修正提取工藝條件為:pH 5.0，加酶量4.3%，溫度50℃，反應時間43 min。在此條件下重復試驗4次，得平均多酚得率為6.43 mg/g，誤差為0.25%，說明采用Box－Behnken試驗設計尋求的最佳工藝條件可行。

表4 典型分析表

3 結論

采用Box－Behnken試驗設計和響應面分析法，得到水酶法提取菜籽粕多酚的最佳工藝條件:液料比 25∶1，pH 5.0，加酶量 4.3%，溫度 50 ℃，時間43 min，此時多酚得率為6.43 mg/g。而在不加糖化酶，其他條件相同情況下，水提菜籽多酚得率4.89 mg/g。相比較水提法提取菜籽多酚，水酶法菜籽多酚含量提高了31.49%，并且該法條件溫和，成本較低。

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Study on the Aqueous Enzymatic Extraction of Polyphenol from Rapeseed Cake

Xiao DiWang Chengming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

Polyphenol is the main anti－ nutritional substance in the rapeseed meal，which has a more extensive utility in the food industry and other areas.Therefore，the reasonable application of the rapeseed protein application is limited.Aqueous enzymatic extraction of polyphenol from rapeseed meal was studied by adopting response surface methodology design.Four factors of pH value，addition of glucoamylase，temperature and reaction time were investigated on the basis of single factor test.By analyzing the response surface plots，the extraction parameters were optimized.Results showed that the optimal aqueous enzymatic extraction，namely using 4.3%glucoamylase to extract the powdered material with a particle size of 80 mesh at a liquid/material ratio of 25∶1(mL/g)with pH 5.0 under 50 ℃ for 43 min，resulted in a polyphenol yield of up to 6.43 mg/g.

rapeseed meal，polyphenol，extraction，aqueous enzymatic，response surface method

S565

A

1003－0174(2012)04－0050－05

2011－07－26

肖頔，女，1986年出生，碩士，農產品加工與貯藏

王承明，男，1964年出生，教授，博士生導師，農產品加工與貯藏，食品安全，食品化學