黑大豆種皮花色苷對亞硝胺體內外合成的阻斷作用

吳 春 陳林林 李俊生

(哈爾濱商業大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

黑大豆種皮花色苷對亞硝胺體內外合成的阻斷作用

吳 春 陳林林 李俊生

(哈爾濱商業大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

在模擬人體胃液的條件下，通過測定N－二甲基亞硝胺(NDMA)的阻斷率、NO2－的形成量和清除率，研究了黑大豆種皮花色苷(BSCA)體外對亞硝化反應的抑制活性;以血清谷丙轉氨酶為測定指標，通過動物試驗考察了BSCA體內對亞硝胺合成的阻斷作用。結果表明，BSCA能明顯阻斷亞硝胺的化學合成，其最大阻斷率為85.9%，對亞硝酸鈉具有較好的清除活性，最大清除率為70.4%;其對硝酸鹽還原酶還原NO3－為NO2－的抑制率可達53.7%。體內阻斷亞硝胺合成的實驗中，BSCA組血清谷丙轉氨酶顯著低于對照組(P＜0.01)。BSCA對亞硝胺的體內外合成均具有較強的阻斷作用。

黑大豆種皮 花色苷 亞硝胺 阻斷作用 體內外

N－亞硝胺(NDMA)是一類強致癌物，它能引起人和動物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤。正常情況下人們直接從食物中攝入亞硝胺的量微乎其微，但形成NDMA類的前體物質硝酸鹽或亞硝酸鹽卻廣泛存在于食物及產生于食物在體內的代謝過程中，特別是亞硝酸鹽在胃液中更易合成NDMA［1－3］。因此，阻斷NDMA合成和清除其前體亞硝酸鹽是防癌抗癌的有效途徑。

黑大豆是傳統的藥食兼用的農產品資源，其種皮富含花色苷類化合物，是天然色素的重要來源。目前對黑大豆種皮花色苷(black soybean coat anthoc－yanin，BSCA)的研究多集中在化學結構、穩定性、抗氧化、清除自由基等方面［4－8］，而對亞硝化反應的抑制活性方面的研究卻鮮有報道。本試驗以黑大豆為原料提取花色苷，研究其體內外清除亞硝酸鈉及對亞硝胺合成的阻斷作用，為尋找安全有效且具有較高食用和藥用價值的亞硝化反應抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑大豆種皮:市售黑龍江省綏化市產黑大豆，手工剝取種皮，干燥后粉碎過60目篩，備用。

昆明種小鼠:由黑龍江省腫瘤研究所實驗動物中心。

氨基比林:錦州九州藥業;谷丙轉氨酶試劑盒:南京建成生物工程研究所;硝酸鹽還原酶提取液:實驗室自制;醋酸鋅、無水乙醇等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

721紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司;XT220A電子天平:瑞士普利塞斯;W202B升降恒溫水浴鍋:上海申勝生物技術有限公司;PHS－25型酸度計:上海偉業儀器廠;UV－VI紫外透射分析儀:北京智源通生物技術研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑大豆種皮花色苷的制備

取一定量黑大豆皮，按料液比為1∶30(g/mL)加入60%(體積分數)的乙醇溶液混合均勻，用0.5 mol/L HCl將溶液pH調至3，在70℃浸提1 h，過濾，收集濾液;將濾渣按同樣的條件重復浸提2次過濾，合并3次濾液于50℃下減壓濃縮得到棕紅色黏稠的粗提液。粗提液用AB－8大孔樹脂分離純化，上樣pH值為1，上樣量與樹脂的體積比為8∶1，按1 mL/min的流速上柱，靜置50 min后，采用70%的乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫液量與樹脂體積比為8∶1。洗脫物經真空冷凍干燥成粉，試驗前用雙蒸水配成所需濃度。

1.3.2 體外阻斷NDMA合成的濃度梯度試驗

在模擬人體胃液的條件下，二甲胺與亞硝酸鈉在37℃條件下，可適宜地生成二甲基亞硝胺，當往BSCA中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時，BSCA優先同亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應，達到阻止亞硝胺生成的目的。據此可以比較相同條件下生成亞硝胺量的多少來反映BSCA阻斷能力的強弱，生成亞硝胺量少，阻斷能力就強，反之則弱。

在紫外光照射下，二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后，再與α－萘胺偶合生成紅色化合物。用分光光度計測出該化合物的吸光度值可計算上述反應液中亞硝胺含量的多少。

精確稱取BSCA 0.1 g用少量蒸餾水溶解，定容至100 mL，質量濃度為0.001 g/mL，作為測試液。

準確吸取 BSCA 測試液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分別加入 pH 3.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液5 mL，1 mmol/L NaNO2溶液 0.5 mL，再加入 1 mmol/L二甲胺0.5 mL，用蒸餾水定容至刻度，在37℃下恒溫1 h。用移液管吸取1.0 mL上述反應液到70 mm的培養皿中，加入0.5%的 Na2CO3溶液0.5 mL，于黑布遮蓋的紫外分析儀上照射15 min，取出后加入1%的對氨基苯磺酸和0.1%的a－萘胺溶液各1.5 mL，加水至溶液精確體積為5.0 mL，然后搖勻放置15 min后，用分光光度計在525 nm處測吸光度值(Ax)，同時做空白試驗(A0)，計算阻斷率。

阻斷率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.3 體外清除NaNO2的濃度梯度實驗

亞硝酸鹽在弱酸性的條件下，能與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色的化合物。準確吸取 BSCA 測試液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分別加入5 mg/L的 NaNO2標準液 2.0 mL，pH 3.0 的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液5 mL，用蒸餾水定容至刻度，在37℃下恒溫1 h。用移液管吸取1.0 mL反應溶液到70 mm的培養皿中，加入 0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，搖勻靜置5 min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min。在確定的最大吸收波長λmax=540 nm處測定吸光度(Ax)，同時做空白試驗(A0)，計算清除率。

清除率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.4 抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2試驗

取 0.001 g/mL BSCA 測試液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 和 1.0 mol/L 的硝酸鈉1.0 mL分別加入25 mL比色管中，用蒸餾水補充至9.0 mL，再加入1.0 mL硝酸鹽還原酶提取液后放入37℃水浴鍋中反應30 min，取出立即加入0.8%對氨基苯磺酸1.0 mL，0.5% α － 萘胺 1.0 mL，室溫下反應15 min后比色，測定吸光度，按繪制的NaNO2標準曲線(c=8.251 8 A －1.347 7，R=0.995。式中:c為亞硝酸鈉溶液的濃度/μg/mL;A為吸光度值;R為相關系數)計算NO－2的形成量，并以此來計算其抑制率。

抑制率IR=(N空－N樣)/N空

式中:N空、N樣分別為未加入BSCA和加入BSCA的NO－2的形成量。

1.3.5 體內阻斷亞硝胺合成試驗

健康68周齡小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，適應環境喂養一周后按體重隨機分成正常組，對照組，BSCA高、中、低劑量組，每組10只。對照組灌胃亞硝酸鈉和氨基比林混合液10 mL/(kg·d)(10 mL內含27.3 mg 亞硝酸鈉和 81.9 mg氨基比林)，BSCA高、中、低劑量組灌胃亞硝酸鈉和氨基比林和不同量的BSCA的混合液10 mL/(kg·d)，正常組灌胃同體積0.9%生理鹽水，每天灌胃一次，共5 d，第6天摘取眼球取血，2 500 r/min離心20 min分離制備血清，用賴氏法在505 nm下測定血清中谷丙轉氨酶的含量。

2 結果分析

2.1 黑豆皮花色苷的提取及純化后得率

由20 g黑豆皮粉末按1.3.1方法對黑豆皮中花色苷進行提取及純化，經真空旋轉濃縮，真空干燥后分別得酒紅色粉末，測定粉末質量，計算出提取及純化后黑豆皮花色苷的得率見表1。

表1 黑豆皮花色苷得率

2.2 體外對NDMA合成的阻斷作用

BSCA體外對NDMA合成的阻斷作用結果見圖1。

圖1 BSCA對NDMA合成的阻斷作用

由圖1可以看出，BSCA對NDMA合成具有明顯的阻斷作用，隨著樣液濃度的增加，BSCA對NDMA合成的阻斷率出現明顯的梯度變化，當加樣量在0.5 ～2.5 mL 時，阻斷率由 44.2%上升至 74.6%，隨著加樣量的增加其作用增強，當加入量達到3 mL后，阻斷能力基本不變。說明BSCA可有效地阻斷亞硝胺的合成。最大阻斷率可達85.9%，出現在加樣量為4 mL處。

2.3 體外對亞硝酸鈉的清除作用

BSCA體外對NaNO2的清除作用結果見圖2。

圖2 BSCA對NaNO2的清除作用

由圖2可以看出，BSCA對NaNO2的清除作用效果與其濃度成正相關關系。隨BSCA取樣量的增加，其對亞硝酸鈉的清除率逐漸增加，當加樣量達到2.5 mL后，再繼續增加BSCA，清除率變化很小。這時清除率最大可達70.4%，說明BSCA可有效地清除亞硝酸鈉。

2.4 抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2試驗

食物中硝酸鹽在人體內經存在于胃液內的多種硝酸鹽還原菌(含有硝酸鹽還原酶)作用轉變成亞硝酸鹽，從而成為在體內形成亞硝胺的前體物質。試驗結果表明BSCA具有抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的作用，結果見圖3。

圖3 BSCA對硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的抑制作用

由圖3可以看出，在BSCA添加量在0.5～3.5 mL范圍內時，隨著BSCA加入量的增大，對硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的抑制率逐漸增大。隨后增大加入量抑制率不再改變，其最大抑制率為53.7%。

2.5 體內對NDMA合成的阻斷作用

以血清谷丙轉氨酶為指標測定，考察BSCA體內阻斷NDMA合成的作用效果，結果見表2。

由表2數據可知，給藥組血清谷丙轉氨酶較對照組明顯降低，其中高劑量組血清谷丙轉氨酶接近正常組，且BSCA的濃度與血清谷丙轉氨酶的量存在劑量效應關系。

表2 黑大豆種皮花色苷體內阻斷N－二甲基亞硝胺合成的效果(x±s，n=10)

3 討論與結論

通過對BSCA體內外抑制亞硝化反應的活性研究，表明BSCA能清除亞硝酸鈉、阻斷亞硝胺的合成和明顯降低血清谷丙轉氨酶含量。由于在體內酸性環境中，亞硝酸鹽與仲胺合成亞硝胺，亞硝胺通過血液循環進入肝細胞中，破壞肝細胞，致使肝組織中的谷丙轉氨酶進入血液中。而BSCA正是通過清除亞硝酸鹽來阻斷亞硝胺的合成，從而起到保護肝組織免受亞硝胺的侵害，降低血清谷丙轉氨酶的作用。黑大豆資源豐富，研究其在防癌方面的作用具有較好的開發應用前景。

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Inhibition of Nitrosamine Synthesis by Black Soybean Coat Anthocyanin in Vivo and Vitro

Wu Chun Chen Linlin Li Junsheng
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076)

The activity of black soybean coat anthocyanins(BSCA)on inhibiting nitrosation was studied by measuring the blocking rate on synthesis of N－nitrosodimethylamine，formation rate and clearance rate of NO2and providing simulated test human gastric juice conditions.The in vivo activity of blocking synthesis of nitrosamine was investigated by taking animal experiment，and taking serum GPT as a test index.The results showed that BSCA had obvious capability of blocking chemical nitrosamine synthesis.The maximum blocking rate of NDMA was 85.9%，the activity of scavenging sodium nitrite was relatively good.The maximum eliminating rate of nitrite sodium was 70.4%.BSCA can prohibit 53.7%of the reducing of nitrate reductase(from NO3－to NO2－).During the process of blocking synthesis of nitrosamine，the serum GPT in BSCA group was significantly lower than that in control group(P ＜0.01).BSCA has strong inhibiting effect on blocking nitrosamine synthesis in vivo and vitro.

black soybean coat，anthocyanin，nitrosamine，inhibition，vivo and vitro

TS202.3

A

1003－0174(2012)01－0025－04

黑龍江省教育廳科學技術研究重點項目(12511z010)

2011－04－07

吳春，女，1962年出生，教授，食品化學