雞腿菇單孢分離和單孢雜交的研究

張樹強，衛彩紅，胡建偉

（1.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學食用菌研究所，新疆 阿拉爾 843300）

發展雞腿菇生產，選育優良的雞腿菇菌種是個關鍵的問題之一。含有某一遺傳因子的孢子在單孢培養的條件下，可以充分表現其潛在的特性而顯示出較大的變異，從而通過單孢菌株的雜交、雜交菌株的篩選可望選育出優良的新菌株[1,2]。以野生雞腿菇和雞腿菇特白36為親本進行研究，利用單孢分離和單孢雜交選育雞腿菇雜交品種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

野生雞腿菇由阿拉爾地區采集；雞腿菇特白36引自江蘇高郵食用菌研究所。

1.1.2 供試培養基PDA培養基

葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，pH自然。

1.1.3 實驗材料預備

超凈工作臺，顯微鏡，PDA培養基倒平板待用，棉蘭染色液、無菌水、75%酒精、三角瓶、無菌棉球、解剖針、解剖刀、鑷子、棉塞、標簽紙，所有材料物品均需做無菌處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 雞腿菇孢子收集

取長至八分熟尚未開傘的的雞腿菇菌株子實體，每菌種各取2個。用解剖刀去除菌蓋表層的鱗片和菌柄部分的泥土，酒精棉球擦拭表層做初次消毒，然后用無菌水進行沖洗數次待用。孢子收集在超凈工作臺中進行，要求在酒精燈火焰上方進行操作。用滅過菌的解剖刀將菌蓋從中間切開，露出菌褶。然后用解剖針挑取小塊菌褶貼在無菌三角瓶的壁上，用棉塞密封。菌褶取菌蓋與菌柄連接處為好。將做好的三角瓶放于冰箱中保存，待用時取出加入無菌水約10 mL，由于雞腿菇孢子液化的特性，所以溶解震蕩即可獲得孢子懸浮液[3]。

1.2.2 單孢分離及單核菌絲

（1）單孢分離

孢子分離工作在超凈工作臺中進行，取出含有雞腿菇菌褶的三角瓶，用注射器吸取10 mL無菌水注入并震蕩，得到孢子懸浮液。在試管架上分兩排各擺放10支滅過菌的空試管，用注射器吸取9 mL無菌水再吸取1 mL孢子懸浮液搖勻，注入第1支試管9 mL即得到10－1的懸浮液。然后把剩有1 mL懸浮液的注射器再次吸入9 mL無菌水搖勻，注入第2支試管9 mL即得到10－2的懸浮液。依次類推分別獲的 10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8 的孢子懸浮液。取最后3種稀釋倍數的懸浮液，用滴管取1滴到載玻片，經棉蘭染色液染色，置于低倍顯微鏡下觀察，以毛細管所吸的菌液大多數每滴為l粒孢子為宜，將該稀釋倍數的懸浮液進行涂布平板[4]。

（2）單核菌絲鑒定

待平板的菌落長到2 cm時，用滅過菌的解剖針挑取邊緣菌絲置于載玻片上，經棉蘭染色液染色，置于顯微鏡下觀察，若無鎖狀聯合可初步認為是單孢萌發而生成的單核菌絲，然后轉接到斜面上培養。

1.2.3 雜交菌株的鑒定

挑取選出長勢旺盛的單核體菌株菌絲，兩兩配對接種于平板培養基或斜面上，兩者間距1.5 cm～2 cm，對峙適溫培養。待兩菌絲接觸后，挑取100處交界處的部分菌絲作為雜交菌株進行刷選。

（1）鏡檢鎖狀聯合

待兩菌絲接觸后，挑取交界處的部分菌絲用棉蘭染色后進行鏡檢，如發現鎖狀聯合，立即將其轉接于新的斜面培養基上，于25℃下培養10 d左右，選出菌絲生長旺盛、菌落形態均勻的菌株，挑取少許菌絲放在顯微鏡下觀察，鑒定確是雙核菌絲后，則初步確定為雜交菌株。

（2）拮抗試驗

拮抗試驗是鑒定菌株間遺傳差異的傳統方法，菌絲之間的拮抗反應是菌株間不同菌株遺傳特性的重要表現。將平板培養基劃分為4格，順時針方向依次劃分為A、B、C、D區。A、C分別接種雜交菌株的菌絲體，B、D分別接種親本的菌絲體，菌絲能互相長進去并連成一片的說明是同種菌絲，若在相交處形成明顯的黃褐色拮抗線，便說明菌種性質不同[5，6]。

（3）液體培養基出菇試驗

將所有的雜交組合分別接種于含有30 mL的液體培養基的三角瓶（100 mL）中，每個雜交組合3次重復。設置25℃下恒溫培養，待菌絲長滿液面溫度降至18℃刺激菇蕾產生，記錄菇蕾產生情況，淘汰不具備結實能力的雜交組合。

2 結果與分析

2.1 雞腿菇孢子收集與單孢分離

采用該方法收集到的孢子污染率低，而且可隨時制作孢子懸浮液進行試驗，不需要每次試驗都進行孢子收集。

2.2 單核菌絲鑒定

單核菌絲與雙核菌絲的區別見表1。

表1 單核菌絲與雙核菌絲的區別

從表1可以看出，試驗各獲得55個單核體菌株。經生長觀察，去除菌絲長勢慢、菌絲纖細、菌絲稀疏的菌株，分別選擇35個長勢旺盛的單核體配對雜交。

2.3 雜交菌株的鑒定

2.3.1 鏡檢鎖狀聯合

在雙核菌絲隔膜處形成的側生特征性突起即為鎖狀聯合，具備鎖狀聯合的是雙核菌絲，表明雜交親和，經過染色鏡檢20個組合沒有鎖狀聯合，80個組合有鎖狀聯合。

2.3.2 拮抗試驗

雜交組合與親本進行拮抗試驗，23個組合與親本菌絲相互交叉，即沒有產生新的性狀，屬于同一菌絲，57個有拮抗線。

2.3.3 液體培養基出菇試驗

雜交組合進行液體出菇試驗，9個沒有產生菇蕾，48個產生了菇蕾。最終確定獲得了48個雜交新菌株。

3 小結與討論

傳統的孢子收集方法如鐘罩法、鉤懸法，污染率高，且需要對收集的孢子懸浮液進行無菌檢查，確定無污染才可以繼續試驗，這就增加了試驗步驟，延長了試驗的時間，所以用三角瓶冷藏菌褶的方法更適合收集雞腿菇的孢子收集。

單孢分離準備工作中，正確使用高溫高壓滅菌鍋。滅菌要徹底，不帶任何雜菌。試驗中使用的平板，要無雜菌，厚度為2 mm～3 mm，平面要均勻。

在顯微鏡檢查培養皿蓋上的菌液時，應要求只有一個孢子的才能接入PDA培養基。

由于異宗結合的四極性菌類，通過單孢子培養菌絲之間進行雜交時，只有1/4交配型產生可孕的雙核體。所以對試驗中雜交菌種，需經鏡檢、提純菌種，并做進一步的出耳試驗，才能選擇出優良的新品種應用到生產上。

[1]黃年來.中國食用菌百科[M].北京：中國農業出版社，1993.

[2]張健.雞腿菇的特性與栽培[J].食用菌，2005(2)：35.

[3]郭美英.金針菇雜交育種研究[J].食用菌，1993，15(4)：4－6.

[4]陳文良.香菇新品種L934和L937的培育[J].華北農學報，1994，9(4)：111－115.

[5]謝芝芳.應用單孢分離技術選育雙孢蘑菇、姬菇新品種[D].四川農業大學碩士學位論文，2005.

[6]肖美麗.糙皮側耳單孢雜交優良菌株選育初步研究[D].華中農業大學碩士學位論，2008.