重組降血壓肽IYPR的分離與穩定性研究*

黃六容，王薇薇，馬海樂，白慧敏，鞠英姿，雷雪香

(江蘇大學食品與生物工程學院江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇鎮江，212013)

高血壓是常見的心血管疾病，發病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟等器官功能性或器質性改變，是引發心、腦、腎和眼血管等各種并發癥的一個重要危險因素［1］。目前市場上廣泛使用的化學合成的抗高血壓藥物長期服用會對人的消化系統、心腦腎等器官造成危害，醫務人員與患者更青睞于非化學合成藥物療法［2－3］。因此，在治療高血壓藥物的研究中，降血壓肽的研究已成為熱點。

降血壓肽是一種血管緊張素轉移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)抑制劑，通過抑制血漿和血管內皮細胞ACE的活性，調節腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統起到降血壓的作用［4］。目前，降血壓肽主要通過酶解法從天然蛋白中分離獲得，由于分離純化工藝復雜、產量低而難以產業化［5－7］。利用基因工程法制備降血壓肽生產周期短，不受原料限制，分離純化工藝簡單，便于大規模生產，因此具有廣闊的前景。

本試驗在成功構建基因工程菌的基礎上，研究了ACE抑制劑IYPR(Ile-Tyr-Pro-Arg)的分離純化方法，并對其熱穩定性、耐酸堿性和抗腸道酶解能力進行研究，以確定所制備的降血壓肽活性是否穩定。

1 材料與方法

1.1 材料

Multiskan FC全波長酶標分析儀，美國熱電公司;GA92-ⅡDB超聲細胞破碎機，無錫上佳生物技術有限公司;LC-20高效液相色譜儀，日本島津;Thermo LXQ液相色譜離子阱質譜聯用儀，美國熱電公司。

大腸桿菌BL21-MIR7，本實驗室構建，具體構建方法過程參考文獻［8］;透析袋，美國光譜醫學公司;Sephadex G-15，臺州市四甲生化塑料廠;His標簽純化樹脂，Biomiga公司;呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)，Sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌體的培養與獲得

取重組大腸桿菌單菌落，用5 mL LB液體培養基(含50 μg/mL卡那霉素)于37℃搖床培養12 h，活化后的菌種按1%接種量接種于含有150 mL LB培養基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，37℃恒溫搖床培養至 OD600為1.0時，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.6 mmol/L，37℃誘導 7 h，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體用0.9%NaCl洗滌2次后于－20℃冰箱保存備用。

1.2.2 重組蛋白的提取與純化

取濕重為1 g的菌體，反復凍融3次，加入破菌緩沖液 8 mL(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，400 W 超聲 40 次(每次超聲時間和間隔時間均為2 s)，破碎液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀加入3 mL包涵體洗滌液I(50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.2%Triton X －100，pH 8.0)1次，再用3 mL包涵體洗滌液II(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗滌2 次，沉淀溶于2 mL包涵體溶解液(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，300 mmol/L NaCl，pH 8.0)，4 ℃溶解 3 h，10 000 r/min離心10 min收集上清液。收集的上清液采用Ni2+-NTA His標簽純化樹脂進行純化，用含有1 mmol/L、20 mmol/L和200 mmol/L咪唑的包涵體溶解液洗去殘留樣品、雜蛋白和目的蛋白。

1.2.3 重組蛋白的腸激酶酶切與標簽的去除

將親和柱回收的目的蛋白，用透析袋(3 500 u)脫鹽24 h，凍干后用含有2 mol/L尿素的Tris-Cl溶解，溶解液與1/10體積的10×腸激酶酶切緩沖液(500 mmol/L Tris-HCl，10 mmoL CaCl2，1%Tween-20，2 U/mL，pH 8.0)混合37℃反應24 h。酶切反應結束后，再用透析袋(500 u)脫鹽24 h，袋中液于4℃、10 000 r/min離心10 min，獲得的沉淀用含8 mol/L尿素的Tris-Cl緩沖液溶解。

1.2.4 串聯多肽的胰蛋白酶酶切與純化

將純化的串聯多肽用pH8.0的Tris-Cl稀釋至0.5 mg/mL，加入終濃度為0.05 mg/mL的胰蛋白酶，37℃溫浴反應4 h后，100℃加熱10 min滅酶。反應液用Sephadex G－15純化，檢測波長為220 nm，上樣量為2 mL，蒸餾水洗脫速度1 mL/min，由HW－2000色譜工作站系統記錄洗脫曲線并收集洗脫峰。

1.2.5 多肽的結構鑒定

用Thermo LXQ質譜儀分析降血壓肽的分子質量。離子源為ESI，質量掃描范圍為50～1 200 u。一級MS掃描完成后，選擇所需的肽段離子進行 MS/MS分析。

1.2.6 ACE抑制活性的測定

體外活性檢測采用FAPGG分光光度法。FAPGG最大吸收峰在340 nm，經ACE酶解后變成FAP和GG，從而發生在340 nm的吸光度下降。通過測定吸光度變化速度可以計算出ACE酶的活性。樣品具體加樣體積和計算方法參照文獻［9］進行。

1.2.7 IYPR的熱穩定性

將溶液多肽IYPR的pH調至8.3，分別在25℃，37℃、50℃、70℃和90℃處理不同時間，冷卻到室溫后測其ACE抑制活性。

1.2.8 IYPR的酸堿穩定性

將溶液多肽IYPR的pH分別調至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，然后在37℃保溫不同時間，調回pH值到8.3，測定其ACE抑制活性。

1.2.9 IYPR的抗消化道酶酶解能力

參考Wu等［10］報道的方法，用0.1 mol/L HCl將多肽溶液的pH調到2.0，加入終濃度為0.1 mg/mL的胃蛋白酶，37℃保溫2 h，然后用0.1 mol/L NaOH將多肽溶液的pH調至8.0，加入終濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶，37℃保溫4 h，沸水浴10 min，鈍化酶，4 000 r/min離心10 min，取上清測定ACE抑制活性。

2 結果與討論

2.1 重組蛋白的親和層析純化

重組蛋白含有6×His標簽，Ni2+-NTA樹脂具有同His融合蛋白高親和力結合的特點。包涵體溶解液過親和層析柱后，依次收集樣品穿透液、洗雜液和洗脫液，經Tricine-SDS-PAGE分析，結果如圖1所示。可見2號樣品穿透液基本不含目的蛋白，3號洗雜液顯示雜蛋白基本去除，4號為200 mmol/L咪唑洗脫液，為目的蛋白，其純度達到90%。

圖1 重組蛋白親和層析純化電泳圖譜

2.2 重組蛋白的腸激酶酶切與標簽的去除

上游His標簽序列與目的肽通過腸激酶的酶切位點Asp-Asp-Asp-Asp-Lys連接，腸激酶可將融合蛋白中的His標簽切下。電泳結果見圖2。分子質量約為8.0 ku(2號條帶)的重組蛋白經過酶切后形成了兩個分子質量更小(3號條帶)的蛋白，且切開的片段大小符合理論值，其中最小的片段是7個IYPR的串聯體，分子質量約為3.7 ku。

經過酶切后，IYPR的串聯體由于疏水性極強，在2 mol/L尿素的緩沖液中只有少量溶解，所以會沉淀析出。而腸激酶反應前，IYPR的串聯體蛋白與標簽結合在一起，標簽的親水性使得一定量的重組蛋白在2 mol/L尿素中可以順利溶解。為了去除標簽部分，使用透析脫鹽法讓串聯多肽析出，標簽留在溶液，然后經過離心得到目的肽。圖2中4號帶為析出的沉淀，為7個IYPR的串聯體，純度約為92%，5號帶為上清液中的標簽。

圖2 重組蛋白的腸激酶酶切電泳圖譜

2.3 Sephadex G-15純化降血壓肽

胰蛋白酶酶切后的樣品用Sephadex G-15對其進一步分離純化，洗脫曲線如圖3所示。從圖3可以看出，胰蛋白酶反應后的混合液經過Sephadex G-15純化后只有一個主峰，由于胰蛋白酶濃度較小，所以胰蛋白酶的峰不是很明顯。

圖3 降血壓肽Sephadex G-15凝膠層析圖

2.4 多肽結構的鑒定

經二級質譜分析得到MS/MS圖譜(圖4)，根據可能產生的碎片可知，只要從圖譜上找出3個y，即可確定該4肽的序列。由圖可見，y1=175，y2=272，y3=435均可在圖譜中找到，因此可以判定這個肽的序列為Ile-Tyr-Pro-Arg。

2.5 IYPR的熱穩定性

不同溫度處理對IYPR活性的影響如圖5所示。從圖5可以看出，當溫度低于50℃時，IYPR的ACE抑制活性隨時間的延長幾乎保持不變;當90℃處理5 h時，其ACE抑制率仍然為初始值的90%。此試驗結果表明:降血壓肽IYPR具有較好的熱穩定性。

2.6 IYPR的酸堿穩定性

圖4 純化多肽的MS-MS圖譜

圖5 溫度對多肽IYPR活性的影響

不同pH對多肽IYPR活性的影響如圖6所示。從圖6可見，在37℃條件下，當處理pH為2～10時，IYPR的活性隨時間的延長幾乎保持不變;在處理pH為12時，IYPR的活性隨時間的延長逐漸下降，當處理時間為5 h時，其ACE抑制率為初始值的87%。可以看出，降血壓肽IYPR在酸性、中性和弱堿性條件下都很穩定，在強堿性條件下活性會下降。

圖6 pH對多肽IYPR活性的影響

2.7 IYPR的抗消化道酶酶解能力

確定一個多肽是否為真正降血壓肽，最直接的方法就是通過動物試驗驗證［11］，但這樣會造成檢測的繁瑣和大量經費的浪費。在胃腸道消化酶作用下，多肽可能抵抗消化或降解失活，或產生新的ACE抑制肽［12］。所以在進行體內活性前，先進行體外模擬消化道環境研究十分必要。

多肽IYPR經過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的活性如圖7所示，結果顯示，經過胃蛋白酶消化后，IYPR的ACE活性升高了13.0%，說明IYPR可能被降解為活性更強的物質，而經過胰蛋白酶消化后，其活性基本沒有變化。因為在制備IYPR時就已經利用了胰蛋白酶將多肽串聯體酶切成單體，所以胰蛋白酶消化處理對活性影響不大。

圖7 消化道酶對IYPR的ACE抑制活性的影響

3 討論

降血壓肽IYPR的作用機理是作為競爭性抑制劑與ACE結合，使得血管緊張素II的生成和激肽的破壞均減少，從而達到降低血壓的目的。IYPR最初是從米酒中分離提取得到的活性肽［13］，食品源的降血壓肽降壓溫和、持久、安全可靠且對正常血壓無影響，無副作用，同時具有減肥、免疫調節、易消化吸收等功能，具有良好的應用前景。但通過酶解從食品中提取得到純度高的肽一般要經過很多分離純化過程，產率也較低。本文通過基因工程法表達得到IYPR，經過幾步純化后，產品純度較高，活性好。針對酶解制備降血壓肽的不足，基因工程技術和微生物發酵手段為降血壓肽的大規模生產帶來了契機。

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