重組降血壓肽IYPR的分離與穩(wěn)定性研究*

黃六容，王薇薇，馬海樂，白慧敏，鞠英姿，雷雪香

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江，212013)

高血壓是常見的心血管疾病，發(fā)病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟等器官功能性或器質(zhì)性改變，是引發(fā)心、腦、腎和眼血管等各種并發(fā)癥的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［1］。目前市場上廣泛使用的化學(xué)合成的抗高血壓藥物長期服用會(huì)對人的消化系統(tǒng)、心腦腎等器官造成危害，醫(yī)務(wù)人員與患者更青睞于非化學(xué)合成藥物療法［2－3］。因此，在治療高血壓藥物的研究中，降血壓肽的研究已成為熱點(diǎn)。

降血壓肽是一種血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)抑制劑，通過抑制血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE的活性，調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)起到降血壓的作用［4］。目前，降血壓肽主要通過酶解法從天然蛋白中分離獲得，由于分離純化工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低而難以產(chǎn)業(yè)化［5－7］。利用基因工程法制備降血壓肽生產(chǎn)周期短，不受原料限制，分離純化工藝簡單，便于大規(guī)模生產(chǎn)，因此具有廣闊的前景。

本試驗(yàn)在成功構(gòu)建基因工程菌的基礎(chǔ)上，研究了ACE抑制劑IYPR(Ile-Tyr-Pro-Arg)的分離純化方法，并對其熱穩(wěn)定性、耐酸堿性和抗腸道酶解能力進(jìn)行研究，以確定所制備的降血壓肽活性是否穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料

Multiskan FC全波長酶標(biāo)分析儀，美國熱電公司;GA92-ⅡDB超聲細(xì)胞破碎機(jī)，無錫上佳生物技術(shù)有限公司;LC-20高效液相色譜儀，日本島津;Thermo LXQ液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國熱電公司。

大腸桿菌BL21-MIR7，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，具體構(gòu)建方法過程參考文獻(xiàn)［8］;透析袋，美國光譜醫(yī)學(xué)公司;Sephadex G-15，臺州市四甲生化塑料廠;His標(biāo)簽純化樹脂，Biomiga公司;呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)，Sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌體的培養(yǎng)與獲得

取重組大腸桿菌單菌落，用5 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)于37℃搖床培養(yǎng)12 h，活化后的菌種按1%接種量接種于含有150 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至 OD600為1.0時(shí)，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.6 mmol/L，37℃誘導(dǎo) 7 h，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體用0.9%NaCl洗滌2次后于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組蛋白的提取與純化

取濕重為1 g的菌體，反復(fù)凍融3次，加入破菌緩沖液 8 mL(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，400 W 超聲 40 次(每次超聲時(shí)間和間隔時(shí)間均為2 s)，破碎液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀加入3 mL包涵體洗滌液I(50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.2%Triton X －100，pH 8.0)1次，再用3 mL包涵體洗滌液II(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗滌2 次，沉淀溶于2 mL包涵體溶解液(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，300 mmol/L NaCl，pH 8.0)，4 ℃溶解 3 h，10 000 r/min離心10 min收集上清液。收集的上清液采用Ni2+-NTA His標(biāo)簽純化樹脂進(jìn)行純化，用含有1 mmol/L、20 mmol/L和200 mmol/L咪唑的包涵體溶解液洗去殘留樣品、雜蛋白和目的蛋白。

1.2.3 重組蛋白的腸激酶酶切與標(biāo)簽的去除

將親和柱回收的目的蛋白，用透析袋(3 500 u)脫鹽24 h，凍干后用含有2 mol/L尿素的Tris-Cl溶解，溶解液與1/10體積的10×腸激酶酶切緩沖液(500 mmol/L Tris-HCl，10 mmoL CaCl2，1%Tween-20，2 U/mL，pH 8.0)混合37℃反應(yīng)24 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，再用透析袋(500 u)脫鹽24 h，袋中液于4℃、10 000 r/min離心10 min，獲得的沉淀用含8 mol/L尿素的Tris-Cl緩沖液溶解。

1.2.4 串聯(lián)多肽的胰蛋白酶酶切與純化

將純化的串聯(lián)多肽用pH8.0的Tris-Cl稀釋至0.5 mg/mL，加入終濃度為0.05 mg/mL的胰蛋白酶，37℃溫浴反應(yīng)4 h后，100℃加熱10 min滅酶。反應(yīng)液用Sephadex G－15純化，檢測波長為220 nm，上樣量為2 mL，蒸餾水洗脫速度1 mL/min，由HW－2000色譜工作站系統(tǒng)記錄洗脫曲線并收集洗脫峰。

1.2.5 多肽的結(jié)構(gòu)鑒定

用Thermo LXQ質(zhì)譜儀分析降血壓肽的分子質(zhì)量。離子源為ESI，質(zhì)量掃描范圍為50～1 200 u。一級MS掃描完成后，選擇所需的肽段離子進(jìn)行 MS/MS分析。

1.2.6 ACE抑制活性的測定

體外活性檢測采用FAPGG分光光度法。FAPGG最大吸收峰在340 nm，經(jīng)ACE酶解后變成FAP和GG，從而發(fā)生在340 nm的吸光度下降。通過測定吸光度變化速度可以計(jì)算出ACE酶的活性。樣品具體加樣體積和計(jì)算方法參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

1.2.7 IYPR的熱穩(wěn)定性

將溶液多肽IYPR的pH調(diào)至8.3，分別在25℃，37℃、50℃、70℃和90℃處理不同時(shí)間，冷卻到室溫后測其ACE抑制活性。

1.2.8 IYPR的酸堿穩(wěn)定性

將溶液多肽IYPR的pH分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，然后在37℃保溫不同時(shí)間，調(diào)回pH值到8.3，測定其ACE抑制活性。

1.2.9 IYPR的抗消化道酶酶解能力

參考Wu等［10］報(bào)道的方法，用0.1 mol/L HCl將多肽溶液的pH調(diào)到2.0，加入終濃度為0.1 mg/mL的胃蛋白酶，37℃保溫2 h，然后用0.1 mol/L NaOH將多肽溶液的pH調(diào)至8.0，加入終濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶，37℃保溫4 h，沸水浴10 min，鈍化酶，4 000 r/min離心10 min，取上清測定ACE抑制活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組蛋白的親和層析純化

重組蛋白含有6×His標(biāo)簽，Ni2+-NTA樹脂具有同His融合蛋白高親和力結(jié)合的特點(diǎn)。包涵體溶解液過親和層析柱后，依次收集樣品穿透液、洗雜液和洗脫液，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。可見2號樣品穿透液基本不含目的蛋白，3號洗雜液顯示雜蛋白基本去除，4號為200 mmol/L咪唑洗脫液，為目的蛋白，其純度達(dá)到90%。

圖1 重組蛋白親和層析純化電泳圖譜

2.2 重組蛋白的腸激酶酶切與標(biāo)簽的去除

上游His標(biāo)簽序列與目的肽通過腸激酶的酶切位點(diǎn)Asp-Asp-Asp-Asp-Lys連接，腸激酶可將融合蛋白中的His標(biāo)簽切下。電泳結(jié)果見圖2。分子質(zhì)量約為8.0 ku(2號條帶)的重組蛋白經(jīng)過酶切后形成了兩個(gè)分子質(zhì)量更小(3號條帶)的蛋白，且切開的片段大小符合理論值，其中最小的片段是7個(gè)IYPR的串聯(lián)體，分子質(zhì)量約為3.7 ku。

經(jīng)過酶切后，IYPR的串聯(lián)體由于疏水性極強(qiáng)，在2 mol/L尿素的緩沖液中只有少量溶解，所以會(huì)沉淀析出。而腸激酶反應(yīng)前，IYPR的串聯(lián)體蛋白與標(biāo)簽結(jié)合在一起，標(biāo)簽的親水性使得一定量的重組蛋白在2 mol/L尿素中可以順利溶解。為了去除標(biāo)簽部分，使用透析脫鹽法讓串聯(lián)多肽析出，標(biāo)簽留在溶液，然后經(jīng)過離心得到目的肽。圖2中4號帶為析出的沉淀，為7個(gè)IYPR的串聯(lián)體，純度約為92%，5號帶為上清液中的標(biāo)簽。

圖2 重組蛋白的腸激酶酶切電泳圖譜

2.3 Sephadex G-15純化降血壓肽

胰蛋白酶酶切后的樣品用Sephadex G-15對其進(jìn)一步分離純化，洗脫曲線如圖3所示。從圖3可以看出，胰蛋白酶反應(yīng)后的混合液經(jīng)過Sephadex G-15純化后只有一個(gè)主峰，由于胰蛋白酶濃度較小，所以胰蛋白酶的峰不是很明顯。

圖3 降血壓肽Sephadex G-15凝膠層析圖

2.4 多肽結(jié)構(gòu)的鑒定

經(jīng)二級質(zhì)譜分析得到MS/MS圖譜(圖4)，根據(jù)可能產(chǎn)生的碎片可知，只要從圖譜上找出3個(gè)y，即可確定該4肽的序列。由圖可見，y1=175，y2=272，y3=435均可在圖譜中找到，因此可以判定這個(gè)肽的序列為Ile-Tyr-Pro-Arg。

2.5 IYPR的熱穩(wěn)定性

不同溫度處理對IYPR活性的影響如圖5所示。從圖5可以看出，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，IYPR的ACE抑制活性隨時(shí)間的延長幾乎保持不變;當(dāng)90℃處理5 h時(shí)，其ACE抑制率仍然為初始值的90%。此試驗(yàn)結(jié)果表明:降血壓肽IYPR具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.6 IYPR的酸堿穩(wěn)定性

圖4 純化多肽的MS-MS圖譜

圖5 溫度對多肽IYPR活性的影響

不同pH對多肽IYPR活性的影響如圖6所示。從圖6可見，在37℃條件下，當(dāng)處理pH為2～10時(shí)，IYPR的活性隨時(shí)間的延長幾乎保持不變;在處理pH為12時(shí)，IYPR的活性隨時(shí)間的延長逐漸下降，當(dāng)處理時(shí)間為5 h時(shí)，其ACE抑制率為初始值的87%。可以看出，降血壓肽IYPR在酸性、中性和弱堿性條件下都很穩(wěn)定，在強(qiáng)堿性條件下活性會(huì)下降。

圖6 pH對多肽IYPR活性的影響

2.7 IYPR的抗消化道酶酶解能力

確定一個(gè)多肽是否為真正降血壓肽，最直接的方法就是通過動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證［11］，但這樣會(huì)造成檢測的繁瑣和大量經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)。在胃腸道消化酶作用下，多肽可能抵抗消化或降解失活，或產(chǎn)生新的ACE抑制肽［12］。所以在進(jìn)行體內(nèi)活性前，先進(jìn)行體外模擬消化道環(huán)境研究十分必要。

多肽IYPR經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的活性如圖7所示，結(jié)果顯示，經(jīng)過胃蛋白酶消化后，IYPR的ACE活性升高了13.0%，說明IYPR可能被降解為活性更強(qiáng)的物質(zhì)，而經(jīng)過胰蛋白酶消化后，其活性基本沒有變化。因?yàn)樵谥苽銲YPR時(shí)就已經(jīng)利用了胰蛋白酶將多肽串聯(lián)體酶切成單體，所以胰蛋白酶消化處理對活性影響不大。

圖7 消化道酶對IYPR的ACE抑制活性的影響

3 討論

降血壓肽IYPR的作用機(jī)理是作為競爭性抑制劑與ACE結(jié)合，使得血管緊張素II的生成和激肽的破壞均減少，從而達(dá)到降低血壓的目的。IYPR最初是從米酒中分離提取得到的活性肽［13］，食品源的降血壓肽降壓溫和、持久、安全可靠且對正常血壓無影響，無副作用，同時(shí)具有減肥、免疫調(diào)節(jié)、易消化吸收等功能，具有良好的應(yīng)用前景。但通過酶解從食品中提取得到純度高的肽一般要經(jīng)過很多分離純化過程，產(chǎn)率也較低。本文通過基因工程法表達(dá)得到IYPR，經(jīng)過幾步純化后，產(chǎn)品純度較高，活性好。針對酶解制備降血壓肽的不足，基因工程技術(shù)和微生物發(fā)酵手段為降血壓肽的大規(guī)模生產(chǎn)帶來了契機(jī)。

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