大米活性肽功能效應研究方法及其應用前景*

方婧杰，梁盈，2，林親錄，吳躍，吳偉，高宇

1(中南林業科技大學稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南長沙，410004)2(華南理工大學淀粉與植物蛋白深加工教育部工程研究中心，廣東廣州，510630)

大米作為人類主要糧食作物之一，其生產與深加工一直受到食品科學家們的高度關注。聯合國糧農組織統計數據顯示，2009/2010年度世界大米產量為456百萬t。這些大米除供應人們日常飲食需要之外，尚有很大比例的大米用作工業發酵和淀粉糖生產原料。而在淀粉糖、味精和有機酸等生產過程中所產生的副產物米渣，其蛋白質含量可高達40%～65%;另一大米加工的副產品米糠，是糙米碾白過程中被碾下的皮層及少量米胚和碎米的混合物，經脫脂后米糠中蛋白質含量可達12%～18%左右［1］。因此，如何大力開發這一豐富的大米蛋白資源，成為近年來國內外的研究熱點。

在我國，由于受技術條件的影響，大米資源深度開發利用仍處起步階段，研究水平落后于發達國家。其蛋白質含量豐富的副產品大部分被用于飼料工業或自然排放，不僅浪費資源，也造成環境污染。而活性肽概念的提出以及分離檢測技術的提高，使人們開始重視對這些大米副產品資源的深加工利用。各種生物、化學方法也逐漸應用到大米活性肽功能效應的研究當中。目前已經獲得了多種大米生物活性肽，并已投入生產應用，如抗氧化活性肽、降血壓活性肽、阿片活性肽等。當前，對大米活性肽繼續展開更為深入的研究成為學術界的重要任務。同時，將其更為廣泛的應用到食品工業當中，亦具有重要的現實意義。不僅為大米蛋白資源開發利用開辟了一條重要途徑，也為活性肽成為功能性食品添加劑和多肽類藥物的研究打開了新局面。

1 大米活性肽的功能效應

1.1 大米抗氧化活性肽

對于大米抗氧化活性肽的研究，一般只是通過酶解制得具有抗氧化活性的大米混合肽。賈俊強［2］等采用超聲波預處理大米蛋白，再利用中性蛋白酶酶解制備出大米抗氧化混合肽，其清除DPPH的能力可達到74.8%，大米蛋白經胃蛋白酶處理，所得酶解物對化學體系產生的O2－、OH-及DPPH自由基有很強的清除能力，還能有效抑制小鼠肝勻漿丙二醛(MDA)生成及紅細胞氧化溶血程度，尤其對亞鐵離子誘導的小鼠肝臟勻漿液的抑制作用最明顯，抑制能力與維生素E相當;申衍豪［3］使用堿性蛋白酶酶解大米蛋白同時給予超聲處理得到大米活性肽，并通過離子交換層析、凝膠色譜和RP-HPLC進行混合肽的分離測定，得到的F3b組分清除DPPH自由基的能力最強，可達89.53%;張強［4］等以脫脂米糠蛋白為原材料，經過胰蛋白酶水解制得米糠肽(肽及氨基酸的混合物)，經測定得出米糠肽具有較強的還原力，對脂質過氧化和油脂過氧化均具有良好的抑制作用，并能抑制H2O2誘導的紅細胞氧化溶血反應和肝組織勻漿脂質過氧化反應的發生。

1.2 大米降血壓活性肽

蔣艷［5］等采用不同的蛋白酶對碎米蛋白進行水解，得出最佳水解酶為風味蛋白酶，同時確定出的最佳酶解工藝條件下ACE抑制肽的抑制率可達85.4%。Yoshiyukis［6］等以大米制黃酒后得到的副產物酒糟為原料，經蛋白酶處理，分離獲得了9種有血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制活性的肽，其中的Arg-Tyr與Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr以100 mg/kg劑量飼喂患原發性高血壓的老鼠30 h后仍有降壓效果;劉志國［7］等分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶單獨或聯合水解米糠蛋白，酶解組分中含有較高ACE抑制活性成分，其相對分子量在500 u以內，其中活性組分主要為Arg-Tyr、Met-Trp、Gly-Val-Tyr或 Gly-Asp-Phe，這些組分共同特征是C端具有苯環樣結構。

1.3 大米免疫活性肽

大米生物活性肽是被中國衛生部批準的具有調節免疫力的功能食品。從大米胰蛋白酶解物中獲得的免疫活性肽，具有促進平滑肌收縮的作用，還可以誘導體外人血白細胞的吞噬活性，并且能刺激白細胞中超氧陰離子的產生［8］;還有報道顯示被命名為Oryzatensin的肽分子氨基酸序列為Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Arg，Oryzatensin亦為一種免疫活性肽肽，濃度為1 μmoL/L時，吞噬作用明顯，吞噬指數為控制值的1.5倍。并且能抑制腫瘤細胞的生長，同時其還具有引起豚鼠回腸收縮，抗嗎啡和免疫調節的活性，主要是通過激活磷脂酶水解溶血磷脂酸釋放花生四烯酸來引起收縮的［9］。

1.4 阿片活性肽

陳季旺［10］等采用氨基酸分析儀、LC-MS對米糠類阿片拮抗肽的結構進行分析，得出其氨基酸序列為Asp-Gly-Ser-Val-Arg;而用胰蛋白酶處理大米蛋白，得到具有阿片活性的肽，其結構為Try-Pro-Met-Try-Pro-Leu-Pro-Arg［11］。

1.5 類阿片拮抗肽

除大米清蛋白酶解產物oryzatensin具有阿片拮抗活性外，陳季旺［12］等采用超濾法從米糠可溶性蛋白酶解物中初步分離提取出一種能拮抗嗎啡成癮性的類阿片拮抗肽，其分子量為530 u氨基酸系列為Asp-Ser-Val-Arg，并通過超濾法提取后發現類阿片拮抗肽活性明顯增強;有研究［13］表明用蛋白酶處理低溫脫脂米糠后，其水解產物具有明顯的類阿片拮抗活性，結構分析確定該成分的氨基酸序列為Asp-Gly-Ser-Val-Arg，相對分子質量為546 u。

1.6 大米風味肽

現代儀器分析表明，酶解大米蛋白可以分離出具有代替谷氨酸鈉(MSG)的風味肽，呈現鮮味。如果將這類肽與礦物質微量元素螯合起來，還可減少礦物質元素之間的競爭。米蛋白及米糠蛋白中含有豐富的谷氨酰胺和天門冬酰胺，通過Alcalase蛋白酶水解作用和脫酰胺作用，使7.6%的肽鍵水解，生產風味肽，可用以取代可能對人體有害的味精類風味增強劑［14］;一些蛋白飼料(如菜籽粕、棉籽粕)適口性差，在飼料中添加谷氨酸多肽可有效掩蓋苦味增強飼料的黏度、改善飼料的適口性，將其應用于畜牧業上能顯著提高動物的采食率，而且來源安全可靠，無毒害作用。

目前，雖然已經發現大米活性肽具有上述生理活性特征，但對其實際應用開發仍處于摸索階段，對大米活性肽功能效應的研究開發也以實驗室階段為主，尚未形成大規模的工業化生產，同時從研究內容可看出，實驗室開發研究亦存在很多問題，如:①對抗氧化活性肽、ACE抑制活性肽研究較集中，而對免疫活性肽、阿片活性肽以及類阿片拮抗肽等研究較少;②對活性肽作用機制的研究較少，特別是在分子水平上的研究更是少有報道;③稻米蛋白序列中是否還存在著其它活性肽，如高F值肽、降脂肽、降膽固醇肽、促生長肽等鮮見報導;④就已確定幾種大米蛋白活性肽看，主要是胰蛋白酶和堿性蛋白酶作用產物，其它類型酶水解產物中肽功能和結構鑒定工作還需深入，以產生和確認更多大米活性肽。因此，要讓大米活性肽真正服務于人類營養和健康，還有許多科學和技術上的問題需要解決。

2 大米活性肽的研究方法及進展

2.1 大米活性肽分離與鑒定的研究方法

由于技術操作、經濟成本等方面的限制，利用酶解大米蛋白質制備生物活性肽成為當前最為安全可行的方法。即主要利用酶對大米蛋白的降解和修飾作用，使其變成可溶性的肽而被提取出來。因此如何對酶解得到的功能肽粗提液可進行分離純化，以提高樣品中功能肽的純度和比活性，成為學者們關心的熱點。當前對于大米源生物活性肽，主要選用離子交換層析、凝膠層析、高效液相色譜及質譜分析等技術(表1)。

2.2 大米活性肽功能與特性的研究方法

近年來，對大米活性肽的研究除主要集中在分離純化與結構測定方面之外，對其生物活性功能的研究也逐漸被許多學者所關心，許多生物、化學方法更是被廣泛應用，現結合其它生物活性肽的研究方法，將所使用或發展中的幾種研究分析方法做一概述(表2)。

表1 分析方法比較

表2 功能研究方法比較

2.2.1 生物檢定法

利用某些生物對某些物質(如維生素、氨基酸)的特殊需要，或對某些物質(如激素、植物激素、抗生素、藥物等)的特殊反應來定性、定量測定這些物質的方法。活性肽是具有生物活性的物質，故生物檢定法是研究活性肽獨特而必需的方法。生物檢定法有兩個目的，直接測定體液中活性肽濃度以及鑒定標記活性肽的生物活性。其方法主要可分為兩大類。

2.2.1.1 在體分析

直接將活性肽作用于生物，并進行相關測定的方法。常規類似的方法有胰島素的小鼠血糖法等，此外還有根據各類生物制品的生物活性不同而建立的各異的方法，如IL－8動員中性粒細胞家兔體內的實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物，供試品用量多，耗時長，精密度和靈敏度較差，變異較大。從而使離體組織分析方法越來越被研究學者所采用。

2.2.1.2 離體組織(細胞)分析

用體外組織、細胞或酶等體系測定活性肽的特異性生物學反應，通過劑量或濃度一效應曲線對被分析物定量的方法。相似的方法有NGF刺激雞背根神經節增長、縮宮素的大鼠離體子宮法等。隨著分子生物學的發展，許多靈敏度高，特異性強的依賴細胞株被建立，細胞培養成為最常用的方法。且根據作用機理的不同，具體操作亦有多種。如細胞增殖法(proliferation assays)［15］，快速靈敏，但特異性稍差;抑制增殖法(antiproliferation assays)［16］，靈敏而專一、檢測系統簡單;減少細胞損傷法(cytopathic effect reduction assays)［17］，是根據具有抗病毒活性的藥物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷，方法直觀靈敏，但可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直接計數法和間接計數法，后者包括MTT法，同位素(3H，14C)摻入法等。此外，還有根據活性肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法，結合酶反應的酶誘導分解法等。

總之，生物檢定法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其不足也顯而易見:(1)樣品多存在于人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反應，影響了方法的專屬性;(2)生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態;(3)依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性;(4)啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度。

2.2.2 免疫學方法

免疫學方法是利用活性肽抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢活性肽，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常用的方法有3種。

2.2.2.1 放射免疫法(radioimmunoassays RIA)

該法是被測活性肽(Ag)，標記活性肽(多為125IAg)與抗體(Ab)的競爭性結合反應，方法的特異性取決于抗原抗體的親和力及標記活性肽的純度，與生物檢定法相比，有簡明、易于控制的優點［18］。

2.2.2.2 免疫放射定量法(immunoradiometrec assays IRMA)

該法中被測活性肽依然是Ag，它先與固定相上的Ab形成Ab:Ag復合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag∶AD125FI-Ab夾心狀。由于Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法，只是對標記抗體的純度要求很高［19］。

2.2.2.3 酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assays ELISA)

ELISA的原理與IRMA相似只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上述兩法相比，ELISA具有使用壽命長、重復性好、無輻射源的優點，并且已有不少實驗證明，它與生物檢定法具有一定的量效關系及相關性［20］，提示它可部分地反映活性肽的生物活性。

免疫學方法的缺點在于:(1)它測定的是活性肽的免疫活性而不是生物活性;(2)不能同時測定代謝物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差;(3)不同來源的抗體與相同的活性肽反應可能有較大的差別;(4)還可能受到內源物質的干擾。

2.2.3 同位素標記示蹤法

放射性同位素標記技術是研究活性肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位素有125I，99mTc，3H，14C，35S 等，其中125I因其放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單而最為常用。標記方法有兩種，1是內標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由于制備復雜而限制了其廣泛應用;2是外標法，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連接于大分子上，因相對簡單而被首選［21］。

同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用于活性肽的組織分布研究，但其缺點亦顯而易見。同位素標記后是否會引起活性肽的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議。已有報道認為［22］，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用，從而導致其體內清除的紊亂。

由以上可知，現代科學技術的發展給活性肽的研究提供了多樣的分析手段，隨著生物化學檢測技術的快速發展，大米源生物活性肽的分析檢測工作也會有更大的突破。

3 大米活性肽的應用

目前對大米活性肽的研究已成為熱門課題，與大米蛋白相比，活性肽具備良好的溶解性，酸、熱穩定性，黏度低等理化性質，而且具有抗氧化、調節免疫力、降血壓、增加食品風味等多種功能。隨著生物工程技術的發展以及人們對食品功能性需求越來越高，將活性肽作為營養補充劑和功能因子添加到食品中的應用也日益廣泛起來。它的添加可以改變食品的品質、風味，也能增加功能性。

3.1 應用到嬰幼兒食品中

大米活性肽是低抗原性蛋白，不會產生過敏反應，而且大米活性肽中含有人體所需定額的各種氨基酸，配比合理，符合WHO/FAO推薦的理想模式，必需氨基酸比較適合2～5歲兒童的需求，將大米活性肽添加到嬰幼兒配方奶粉、米粉中，也可添加到一些食物易過敏的兒童膳食中，作為重要的植物蛋白來源，有益嬰兒營養吸收，促進嬰幼兒生長、發育［23］。

3.2 應用到保健食品中

大米活性肽是已經被衛生部批準為具有調節免疫功能的食品成分，具有一定的藥用保健價值，具有防病、治病，調節人體生理機能的功效。因此，可以作為功能性成分添加到保健食品當中［24］。

3.3 應用到烘焙食品中

大米活性肽具有保濕性，可防止面包老化。另外活性肽又是面包酵母的優良營養物質，可使酵母發酵旺盛，從而起到改善面包品質的作用。凡是在烘焙食品中添加活性肽的食品，口感口味都良好，加熱的活性肽有使面包質地柔軟的作用［25］。

3.4 應用到乳飲料、植物蛋白飲料中

大米活性肽具有良好的溶解性，在受熱或酸堿離子濃度的條件下，抗凝性好，有較好的吸濕性，低黏度，流動性和熱穩定性好。而且在體內吸收快，利用率高。在生產液態奶和植物蛋白飲料中，適量加入這樣的生物活性肽，不但可以提高產品的穩定性，更可極大地提高產品的營養性和保健性，使產品的品質提升到更高的檔次［26］。

3.5 應用到普通食品中

大米活性肽的低粘度、良好的吸濕性和保濕性、較強的抗氧化性使其可廣泛應用于植物蛋白制品、魚肉蛋白制品及糖果糕點中，不僅可以改善它們的質構和口感，而且可以改進它們的品質，提高保質期［27］。

3.6 起泡劑及乳化劑

經酶處理得到的大米活性肽水解液的溶解性比大米蛋白液有明顯提高，同時適度地水解和脫氨作用使大米多肽的乳化能力和乳化穩定性也增加了，使其具有良好的起泡性能，可作為起泡劑用，亦可用作乳化劑［28］。

4 大米生物活性肽開發存在的問題及展望

目前，我國雖在大米生物活性肽的研究開發方面取得了一定的進展，但是還存在著許多問題，如:①對大米活性肽功能特性的開發研究主要仍處于實驗室階段，大規模的工業化生產尚未形成;②大米活性肽的分離與鑒定急需高效和靈敏的技術或分析平臺;③能都作為食品添加劑的大米活性肽，其在食品加工及貯藏過程中的變化動力學少有報道;④對大米活性肽含量的檢測問題、生產標準等問題尚未形成明確的方法體系，限制了其進一步的市場化。

因此，對大米活性肽的深入研究應當從以下幾個方面入手:(1)深入研究大米活性肽的生理功能、釋放機制、受體結合、降解失活以及類似物的結構與活性的關系，更大程度上的開發出更多生理活性功能的大米活性肽;(2)大米活性肽品種多、功能全、應用范圍廣、高效和無毒副作用的優點不僅僅只被應用于食品等行業，也應試圖將生物活性肽應用在更多的領域(如醫藥、飼料等領域);(3)利用DNA重組、細胞培養等生物工程技術生產活性肽將是一種很有前景的方法，節約成本，其產量、純度也會大大提高。(4)開發先進的分析方法對大米活性肽的安全性進行檢測。其中，通過分子生物學手段來評估大米活性肽的功能機制，應該是最為行之有效的方法。可以將多種大米活性肽作用于各種細胞模型，以檢測其對細胞的生理代謝活動影響，從而在分子水平上深入了解大米活性肽的功能機制，最終達到更好的在食品行業發揮大米活性肽生物功能的目的。

我國具有豐富的大米蛋白資源，其綜合利用前景廣闊。這些來源于大米蛋白的各種活性肽，不僅具有較高的生理活性和明確的生理功能，而且無毒無害，是天然醫藥保健品的寶庫，有待于深入發掘。營養學家也在大力推進大米活性肽在食物中的應用。隨著對大米活性肽的營養功效、生理功效及其他功能的更多、更深入的研究，大米蛋白產品的開發利用必將受到食品界的高度重視，大米活性肽必將更廣泛、科學地運用于食品工業。同時，開發新型功能性米制品，以豐富食品市場，改善人們飲食結構，提高資源利用率，也將會為我國的健康事業和經濟發展做出更大的貢獻。

［1］趙麗霞，劉學文.米糠多肽蛋白粉酶法生產新工藝研究［J］.江西食品工業，2009(1):37－42.

［2］賈俊強，馬海樂，曲文娟，等.超聲預處理大米蛋白制備抗氧化肽［J］.農業工程學報，2008，24(8):288－293.

［3］申衍豪.大米抗氧化活性肽的分離純化和性質研究［D］.長沙:中南林業科技大學，2011.

［4］張強，周正義，馬玉涵，等.米糠肽抗氧化活性的研究［J］.中國糧油學報，2008，23(5):9－12.

［5］蔣艷，王澤南，王博，等.碎米蛋白ACE抑制肽制備工藝的研究［J］.糧食與油脂，2012，37(5):129－132.

［6］Yoshiyuki S，Keiko W.Structure and activity of angiotensin I coverting enzyme inhibitory peptides from sake and sake lees［J］.Biosci Biotech Biochem，1994，58(10):1 767－1 771.

［7］劉志國，吳瓊，呂玲肖，等.酶解米糠蛋白分離提取ACE抑肽及其結構研究［J］.食品科學，2007，28(3):223－227.

［8］鄭睿行，馬力.免疫調節肽的概述［J］.生命科學儀器，2008，6(10):9－12.

［9］Takahashi M，Moriguchi S，Yoshilawa M，et al.Isolation and characterization of oryzatensin:A novel bioactive peptide with ileum-contracting and immunomodulating activities derived from rice albumin［J］.Biochemistry＆ Molecular Biology International，1994，33:1 151 －1 158.

［10］陳季旺，陶冠軍，姚惠源，等.米糠類阿片拮抗肽的氨基酸序列分析［J］.食品科學，2005，26(12):107－110.

［11］余奕珂，胡建恩，白雪芳，等.源于食品蛋白質的血管緊張素I轉換酶抑制肽［J］.食品與藥品，2006，4A:16－21.

［12］陳季旺，孫慶杰，姚惠源.預分離米糠可溶性蛋白類阿片拮抗肽的超濾工藝［J］.食品科技，2003(12):21－24.

［13］陳季旺，孫慶杰，姚惠源，等.利用米糠蛋白制備阿片拮抗肽和降血壓肽的研究［J］.食品科技，2005(04):88－91.

［14］金融，趙念，陳莎莎，等.大米蛋白的研究與利用［J］.食品工業科技，2007，28(1):231－234.

［15］韓建群，修瑞娟.兩種細胞增殖分析方法的比較性研究［J］.山東醫藥，2012，52(12):70－72.

［16］Yang ZG，Chen AQ，Liu B.Antiproliferation and apoptosis induced by evodiamine in human colorectal carcinoma cells(COLO －205)［J］.Chemistry ＆ Biodiversity，2009，6(6):924－33.

［17］Sparreboom A，Rongen HAH，Bennekom WPV.Assays for interferons a n d interleukins in biological matrices［J］.Anal Chim Acta，1994，295(1):1.

［18］馬南花，曾貝貝，覃堅，等.時間分辨免疫熒光法和放射免疫法測定血清C-肽的偏差評估［J］.檢驗醫學，2010(11):903－905.

［19］戴海玲，庫艷麗.兩種不同方法檢測CA125、CA153、CA199的觀察［J］.中國熱帶醫學，2010，10(9):1 145－1 146.

［20］Stute N，Furman WL，Schell M，et al.Pharmacokinetics of rec ombinant human goa nulocyte-macrophage colonystimulating factor in children after intravenous an d subcutaneous administration［J］.Pharmaceu Sci，1995，84(7):824.

［21］張建平，莊峙廈，陳成祥，等.同位素示蹤SEC-ICP—MS研究大鼠體內鎘的形態［J］.分析試驗室，2009，2(1):21－25.

［22］Kuo BS，Nordblom GD，Wright DS.Perturbation of epidermal growth factor cleara nce after radioiodination and its implications［J］.Pharmaceu Sci，1997，86(3):290.

［23］任國譜.高蛋白肽奶粉的研制［D］.上海:華東師范大學，2005:1－86.

［24］閆金萍，米糠深加工產品的開發與研究進展［J］.食品科技，2007(6):243－247

［25］嚴松，任傳英，孟慶虹，等.碎米及米糠在食品工業中的綜合利用［J］.食品科學，2011，32(增刊):132－134.

［26］Renuka Devi R，Arumughan C.Antiradical efficacy of phytochemical extracts from defatted rice bran［J］.Food Chen Toxicol，2007，45(10):2 014 －2 021.

［27］彭清輝，林親錄，陳亞泉.大米蛋白研究與利用概述［J］.中國食物與營養，2008(8):34－36.

［28］吳嬌.米渣蛋白改性和改性產物的乳化性及應用和的研究［D］.南昌:南昌大學，2007.