毛細管氣相色譜內標法同時測定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA

黃杰，余孔捷，錢疆，王丹紅，蔡姍姍，薛芝敏

(福建出入境檢驗檢疫局，福建福州，350001)

研究表明，亞麻酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是必需脂肪酸，具有多種保健功效，DHA更被稱為“腦黃金”，廠家在嬰幼兒奶粉中添加亞麻酸、ARA和DHA成為了商品賣點。由于這些脂肪酸在食品中含量低，化學性質不穩定，對測定方法的準確性和重現性提出了更高的要求。現行國標方法尚無內標法［1］。以往文獻中有使用十七烷酸甲酯為內標物［2－3］，缺點是奶粉中含有該成分［4］，其色譜峰位置與被測組分相距較遠;有使用三苯乙烯為內標物［5］，缺點是其為有毒有害物質，理化性質與被測組分完全不同。二十一烷酸甲酯則基本符合內標物的理想條件，為此本研究建立了氣相色譜內標法，可同時測定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量，結果準確、重現性好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀，Agilent 6890N(配FID檢測器);分析天平，上海梅特勒-托利多公司 AE240型(精度0.000 01 g)。

亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA和二十一烷酸等甲酯標準品，上海安譜科學有限公司，平時置于4℃冰箱保存，臨用時配制標準溶液;亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA等甲酯標準溶液根據需要濃度用正庚烷為溶劑配制;二十一烷酸甲酯內標溶液(2.039 mg/mL)，用甲苯為溶劑配制;氫氧化鉀-甲醇溶液(2 mol/L)，用甲醇為溶劑配制。正庚烷、甲苯、甲醇、氫氧化鉀均為AR級。

1.2 試樣及其前處理

奶粉應密封冷藏。檢測時準確稱取試樣1.500 g于50 mL棕色容量瓶內，準確加入1.00 mL內標溶液，搖勻，再加入4 mL正庚烷，搖勻。

甲酯化處理:于上述棕色容量瓶內加入5 mL氫氧化鉀-甲醇溶液，室溫下不斷搖勻20 min，再加入蒸餾水使液面接近容量瓶口，加塞靜置約1 min分層后，加入2滴無水乙醇于液面，加塞并以封口膠膜密閉，于冰箱內靜置過夜，取上清液為測試液供氣相色譜儀檢測。

選用各種品牌奶粉6份，密封罐裝商品。按本法測定，每份平行3次，計算平均值及標準差。

1.3 色譜分析條件

CP-Sil88FAME石英毛細管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm;載氣，高純氮氣(99.999%);柱溫，采用程序升溫:初始溫度140℃，保持5 min，再以2℃/min速率，升溫至220℃，保持13 min;進樣口溫度為250℃，壓力為160 kPa，分流比為30∶1;檢測器溫度為280℃，氫氣為40 mL/min，空氣為300 mL/min。進樣量為 1 μL。

1.4 線性試驗

根據國家標準對嬰幼兒配方奶粉的要求［6］及奶粉樣品的實際檢測結果，配制不同濃度范圍的4種被測組分及內標物混合標準溶液(詳見表1)。準確吸取5 mL混合標準溶液于50 mL棕色容量瓶，進行甲酯化處理，制得測試液;平行試驗3份。測定值取平均值，計算線性回歸方程、相關系數、相對校正因子;根據色譜基線信噪比S/N=3計算檢出限。

1.5 回收試驗

選用低含量亞麻酸、不含ARA、EPA和DHA的奶粉樣品進行試驗。加標組:稱取試樣1.500 0 g于50 mL棕色容量瓶，準確加入1 mL內標溶液;分別準確加入4種標準溶液各1 mL(添加量詳見表3)，搖勻后，進行甲酯化處理、制得測試液;平行試驗6份。試樣組:步驟同“加標組”，但不加入4種標準溶液，加入4 mL正庚烷。根據加標組和試樣組的測定值，計算回收率和變異系數(CV)。

1.6 結果計算

根據某標準溶液及內標溶液濃度和用量及其色譜峰面積，計算某標準物質與內標物的相對校正因子fi:

式中Ms和As為某標準溶液中某標準物質的質量(mg)及其峰面積;Mi和Ai為某標準溶液中內標物的質量(mg)及其峰面積。

根據測試液中某被測組分色譜峰面積及內標溶液濃度和用量及其色譜峰面積，計算試樣中某被測組分含量X，計算公式為:

式中:Mci和Aci為測試液中內標物的質量(mg)和色譜峰面積;Ac為測試液中某被測組分的色譜峰面積;M為試樣稱取量(g);測定值應由脂肪酸甲酯轉換為脂肪酸，故乘以系數Q1，再由脂肪酸轉換為脂肪酸甘油三酯，故除以系數 Q2(亞麻酸的 Q1為0.952 0，Q2為0.956 0;ARA 的 Q1為 0.956 0，Q2為0.959 7;EPA 的 Q1為0.955 7，Q2為0.959 2;DHA的 Q1為 0.959 0，Q2為 0.962 4)［1］。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理、檢測結果及其色譜圖

內標溶液使用甲苯為溶劑，目的是提高溶脂效果，這與國標方法［1］相一致。使用棕色容量瓶做甲酯化反應容器的優點:1是避光;2是樣液與試劑約10 mL混合液在50 mL容量瓶內易于反復搖勻，使之反應充分，避免水浴加熱，降低熱分解作用;3是加入蒸餾水后，使上層有機相進入細窄瓶頸，有利于兩相分離，同時使液面接近瓶口，減小瓶內上層液面與瓶塞之間的空間，降低氧氣分解作用，可不需充氮氣。滴加乙醇有加速上層有機相澄清的作用。

通常天然奶源的奶粉含有少量亞麻酸，而ARA、EPA和DHA含量極微，因而把亞麻酸、ARA、EPA和DHA作為營養強化劑加入奶粉中，生產出嬰兒配方、幼兒配方等多種奶粉，其中以添加ARA和DHA價值最高，表1列出了各種奶粉的測定結果。

表1 各種奶粉樣品的測定結果(n=3)

圖1為嬰兒配方奶粉樣品色譜圖、圖2為幼兒配方奶粉樣品色譜圖，C18∶3為亞麻酸、C21∶0為內標物、C20∶4為 ARA、C20∶5為 EPA、C22∶6為 DHA。圖1 中各脂肪酸分離良好，內標物色譜峰與被測組分的色譜峰位置較近。若使用十七烷酸甲酯為內標物，其色譜峰在30 min位置，與被測組分相距較遠;如使用二十三烷酸甲酯為內標物，色譜峰位置離ARA、EPA和DHA更近，但與二十碳三烯酸和二十二碳一烯酸的色譜峰難以分開;如使用二十四烷酸甲酯為內標物則與EPA的色譜峰難以分開。因此二十一烷酸甲酯是較理想的內標物，其分子結構、理化性質與被測組分相似，奶粉通常不含該物質，互不干擾，而且化學性質穩定，標準物質易購，純度有保證，做內標物使用，可以克服多不飽和脂肪酸標準物質易氧化、不易保存，價格昂貴的缺點。

2.2 線性范圍及檢出限

圖1 進口B嬰兒配方奶粉色譜圖

在測定濃度圍內，FID響應值與被測組分及內標物濃度的線性關系良好，相關系數均在0.998以上。4種被測組分的相關試驗數據見表2。根據色譜基線信噪比，計算出4種被測組分的檢出限;按本方法取樣量1.500 g及加入甲苯1 mL、正庚烷4 mL用量，以表2檢出限最大值0.003 mg/mL計算，試樣的檢出限為0.010 mg/g即1.0 mg/100 g，基本滿足國標方法［1］的要求。

圖2 進口C幼兒配方奶粉色譜圖

表2 線性測定與檢出限試驗結果(n=3)

2.3 回收率與重現性

由表3可見，4種被測組分的回收率為95.4%～104.7%，試樣組和加標組的變異系數為2.168%～4.368%，表明本方法的準確性、精密度均良好。應注意的是，由于試樣中DHA、EPA、ARA和亞麻酸的含量通常較低，在使用儀器軟件平臺對被測組分色譜峰面積進行計算時，如采用自動積分模式計算，可能導致檢測數據變化較大，建議采用手動積分模式計算。

表3 回收率和精密度試驗結果(n=6)

3 結論

目前進口嬰幼兒奶粉占據國內大部分市場，其品牌多、種類雜，品質參差不齊。檢測亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量是評價嬰幼兒奶粉品質優劣的重要指標，本研究建立的以二十一烷酸甲酯為內標物的氣相色譜法，可同時測定奶粉中亞麻酸、ARA、EPA和DHA含量，結果準確，重現性好，為食品安全監管、保護消費者權益提供了可靠的檢測方法。

［1］中華人民共和國國家標準［S］.GB 5413.27－2010.

［2］張鳳枰，索有瑞，趙先恩，等.毛細管氣相色譜內標法測定核桃油中的脂肪酸［J］.天然產物研究與開發，2007，19:262－267.

［3］王映強，賴炳森，顏曉林，等.氣相色譜法測定紫蘇子油中α-亞麻酸的含量［J］.中國生物藥物雜志，1998，19(2):91－92.

［4］劉梅森，何唯平，賴敬財，等.奶粉脂肪酸與乳制品風味關系研究［J］.中國乳品工業，2008，36(2):13－15.

［5］吳偉都，金世梅，朱慧，等.氣相色譜內標法測定奶粉及乳飲料中的DHA和EPA［J］.中國食品添加劑，2005(1):106－108.

［6］GB10767－2010.較大嬰兒和幼兒配方食品［S］.