油茶籽殼原花青素的分離純化*

余紅軍，鄭生宏，李立祥

1(浙江綠世界生物工程有限公司，浙江湖州，313300)2(浙江麗水市農業科學研究院，浙江麗水，323000)3(安徽農業大學茶葉生物化學與生物技術教育部、農業部重點實驗室，安徽合肥，230036)

原花青素(proanthocyanidins，簡稱PC)是由單體黃烷-3-醇類物質以不同聚合度連接而成的多酚類化合物，有人將其歸為縮合鞣質［1－3］。這類化合物由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成，最簡單的是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體［4－5］。研究表明，原花青素具有廣泛的生化和藥理活性，如抗氧化、清除自由基、護肝解毒、抗菌及抗癌等功能;目前已經成為醫藥、保健品的重要原料及食品、化妝品的重要添加劑;它廣泛存在于各種植物(如葡萄、銀杏、白樺樹等)的核、殼、種籽中［6－7］。

目前，國內外學者對原花青素的研究主要集中在葡萄籽、沙棘、山楂等材料［8，9］，對油茶籽殼中原花青素的研究較少，而中國油茶(Camellia oleifera Abel)資源豐富，據統計，全國現有油茶面積400多萬hm2，年產油茶籽60萬t，因此，充分利用油茶籽資源，不僅變廢為寶，且還會帶來巨大的經濟效益［10－11］。本文利用Sephadex LH－20柱色譜分離純化油茶籽殼原花青素，并對柱層析純化得到的原花青素進行分析和鑒定，為油茶籽殼中原花青素的進一步研究和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油茶籽殼，安徽黃山謝裕大茶業有限公司提供;原花青素對照品(天津尖峰天然產物有限公司，源自葡萄籽，純度＞95%);GA(沒食子酸)、GC(沒食子兒茶素)、EGC(表-沒食子兒茶素)、C(兒茶素)、EC(表-兒茶素)、EGCG(表-沒食子兒茶素酸酯)、ECG(表-兒茶素沒食子酸酯)，Sigma公司;色譜級甲醇、乙腈、醋酸(美國Tedia公司);香草醛(天津市光復精細化工研究所);乙醇(分析純，上海振企化學試劑有限公司);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharamacia biotech公司);其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 主要儀器

UV－2102C型紫外可見分光光度計(上海尼龍科儀器有限公司);U3010紫外分光光度計(日本日立公司);DHG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);HH－6型電熱恒溫水溶鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司);KQ－500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Waters－600高效液相色譜儀(美國Waters公司);LGJ－12冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)AB104-N型電子天平(Mettlet-Toledo Group);SENCO R系列旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司);JFSD－100粉碎機(上海嘉定糧油儀器有限公司);BECKMAN COULTER Avanti J－30I型高速冷凍離心機(美國貝克曼公司);層析柱(2.5 cm×50 cm，上海錦華實驗器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料的預處理

將油茶籽殼放于烘箱中40℃條件下烘4 h，取出后用粉碎機粉碎至100目，后置于干燥器中備用。

1.3.2 原花青素的提取［12］

準確稱取2.0 g100目的油茶籽殼粉于100 mL具塞三角瓶中，按1∶70(g∶mL)的料液比加入體積分數(下同)60%的乙醇溶液140 mL，在60℃下用300 W的超聲功率浸提30 min，后冷卻至室溫，離心(5 000 r/min，10 min，常溫)，取上清液，經旋轉蒸發(60℃)濃縮至1/10體積左右，然后加入4倍體積的95%乙醇，攪拌均勻后置4℃冰箱中靜置12h，離心(5 000r/min，10min，4℃)，上清液即為原花青素粗提液。

1.3.3 原花青素的 Sephadex LH－20凝膠柱純化［13］

葡聚糖凝膠Sephadex LH－20預先用體積分數為60%乙醇充分溶脹，緩慢倒入層析柱(2.5 cm×50 cm)，使其均勻沉降，用60%乙醇平衡柱床，凝膠柱床體積為230 mL。將1.3.2中的原花青素粗提液45℃真空濃縮至5 mL，用一次性吸管逐滴將樣液緩慢加入到柱床表面，待樣品完全滲入凝膠后，依次用體積分數60%乙醇、60%丙酮洗脫，流速1.0 mL/min，自動部分收集儀每5.3 min收集一管，每隔5管檢測A500(原花青素的香草醛-鹽酸法吸收峰)，繪制洗脫曲線。將兩種流動相洗脫下來的組分分別收集，真空冷凍干燥得樣品1和樣品2。

1.3.4 原花青素的分析鑒定

1.3.4.1 可見分光光度分析

以試劑空白作參比，利用香草醛-HCl法［12］，每隔5管測定洗脫液吸光值，以洗脫體積/mL為橫坐標，A500為縱坐標，繪制Sephadex LH－20洗脫曲線。

1.3.4.2 原花青素的含量測定

將真空冷凍干燥得到的樣品1和樣品2分別稱重，計算得率。

樣品得率=樣品質量(mg)/2.0(g)

同時，用60%乙醇分別將樣品1、樣品2全部溶解，利用香草醛-HCL法［12］得出樣品溶液中原花青素的濃度，從而計算出樣品1、樣品2的純度。

純度/%=［N×V×/樣品質量(mg)］×100

式中:N，樣品溶液中原花青素的濃度(mg/mL);V，樣品溶液總體積(mL)。

1.3.4.3 紫外光譜分析［14］

將樣品1溶液、樣品2溶液和用60%乙醇溶解的原花青素標準品溶液，在200～400 nm內進行紫外光譜掃描，觀察所得圖譜在280 nm處是否有特征吸收峰。

1.3.4.4 花青素反應［15］

取適量原花青素標準品、樣品1溶液、樣品2溶液，利用正丁醇-鹽酸法比色，觀察溶液顏色變化，同時在500～700 nm內進行波段掃描，觀察所得圖譜在550 nm處是否有吸收峰。

1.3.4.5 油茶籽殼原花青素的HPLC分析

標樣:7種兒茶素標準品，原花青素標準品。

HPLC色譜條件:Waters600泵，2489 Dual Absorbance Detector，LCsolution液相色譜工作站;色譜柱:大連Elite Hypersil ODS-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動相:A相為2%的色譜級醋酸水溶液，B相為乙腈;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:280 nm;進樣量:5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 油茶籽殼原花青素高效液相色譜梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 Sephadex LH－20洗脫特性

由圖1可以看出，Sephadex LH－20分部洗脫分離原花青素組分，在A500處有2個大的洗脫峰，將其真空冷凍干燥，得樣品1(39 mg)和樣品2(24.2 mg)，然后對各分離組分進行檢測分析。

圖1 Sephadex LH－20動態洗脫曲線

2.2 原花青素含量測定

樣品1得率=19.5 mg/g，純度3.8%;樣品2得率12.1mg/g，純度57.3%。說明60%乙醇溶液洗脫部分的原花青素含量低，可能主要為單體兒茶素及其他水溶性成分［13］;而主要的原花青素部分由60%丙酮溶液洗脫下來，這表明60%丙酮洗脫原花青素的效果較好。

2.3 紫外光譜分析

原花青素標準品在280 nm處有最大吸收峰，由圖2可知，樣品2也在280 nm處有最大吸收，而樣品1由于原花青素純度低，與標準品溶液的光譜圖略有偏差。

圖2 樣品和PC標準品的紫外掃描圖譜

2.4 花青素反應

原花青素在酸性條件下加熱生成最大吸收波長在550 nm附近的紅色花青素，此法對原花青素具有專一選擇性，也是一種測定原花青素含量的較好方法。

對樣品1和樣品2進行花青素反應，結果表明，樣品1反應后顯淡棕色，樣品2和原花青素標準品均呈現紅色。此外，從圖3的掃描圖譜中也可以看出，原花青素標準品進行花青素反應后，在550 nm處有最大吸收峰，樣品2亦在550 nm處呈現特征吸收值，而樣品1可能由于原花青素的含量較低，未呈現特征峰值。

圖3 樣品和PC標準品Porter反應后的掃描圖譜

2.5 樣品的HPLC分析

樣品1、樣品2溶液經HPLC檢測，對所得色譜圖與兒茶素混合標準品及原花青素標準品的色譜圖進行比較分析。

由圖4可知，兒茶素標準品的GA、C、EC、EGCG、ECG與原花青素標品組分的保留時間相同，結合文獻報道［16］，可以推斷原花青素標品含有 GA、C、EGCGG、ECG等兒茶素組分。

圖4 七種兒茶素標品和原花青素標品的色譜圖

從圖5中可以看出，樣品中的物質比較復雜，樣品1、2與原花青素標品在GA、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ位置均有相同的保留時間;樣品2與原花青素標品在ECG位置有相同的出峰時間;因此，可以推斷油茶籽殼中可能存在原花青素的單體物質(GA、ECG等)。

圖5 樣品和原花青素標品的色譜圖

3 結論

采用Sephadex LH－20凝膠柱純化油茶籽殼原花青素粗品，使用60%的丙酮水溶液作為洗脫液洗脫效果較好，所洗脫出的原花青素含量達57.3%，遠高于60%乙醇洗脫出的原花青素含量(3.8%)。

通過對樣品進行光譜掃描和花青素反應，初步推斷洗脫出的樣品含有原花青素，高效液相色譜分析表明，從Sephadex LH－20洗脫下來的樣品組分可能含有原花青素的單體物質(GA、ECG)。

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