發(fā)酵紅皮蘿卜中硝酸還原菌的分離篩選*

郭雙霜，葛焱，陳安均，3，蒲彪，3，曾駿，付莎莉

1(四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安，625014)2(南京旅游職業(yè)學院酒店管理系，江蘇南京，211100)3(四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點實驗室，四川雅安，625014)

泡菜是一種傳統(tǒng)的大眾化發(fā)酵食品，因其獨特的冷加工方式，有利于保持原料的營養(yǎng)成分、色香味。食用泡菜，除吸收蔬菜的營養(yǎng)成分外，泡菜中的有機酸等，可促進胃腸蠕動，幫助消化，同時可增強機體免疫功能，抑制腸道中腐敗細菌的生長。但是，泡菜中亞硝酸鹽問題也不可忽視。幾乎所有的研究都證實，泡菜在自然發(fā)酵過程中硝酸鹽含量呈下降趨勢，亞硝酸鹽含量先升高后下降。具有硝酸鹽還原酶的細菌，如大腸桿菌、副大腸桿菌等是使蔬菜產(chǎn)生大量亞硝酸鹽的主要因素［1］。從20世紀40年代開始，展開了一項對泡菜發(fā)酵過程中自然細菌變化的研究，此研究結(jié)果為解釋某些類型的泡菜品質(zhì)差提供了依據(jù)。隨之出現(xiàn)了大量關(guān)于發(fā)酵蔬菜中雜菌的研究報道。Fleming等［2］發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中腸道菌、總好氧菌和乳酸菌在1～3天內(nèi)快速生長，并對黃瓜中出現(xiàn)的丁酸腐敗菌 Clostridium tertium 進行了研究［3］。何淑玲［4］研究發(fā)現(xiàn)，泡菜發(fā)酵過程中，泡菜表面微生物的硝酸還原酶的活性與泡菜中亞硝酸鹽含量的變化趨勢相同，亞硝酸鹽的產(chǎn)生是泡菜表面雜菌將硝酸鹽還原所致。紀鳳娣［5］研究發(fā)現(xiàn)，微生物的硝酸還原酶對亞硝峰的形成起主要作用。可見，泡菜在泡菜發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽含量、雜菌總數(shù)、泡菜發(fā)酵中微生物硝酸還原酶酶活三者存在一定的關(guān)系，為此，本文對發(fā)酵蘿卜中細菌和大腸桿菌數(shù)量與亞硝酸鹽含量的變化規(guī)律進行研究，對其中能還原硝酸鹽的菌株進行分離篩選，研究其硝酸還原酶酶活。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養(yǎng)基

紅皮蘿卜:生姜、辣椒，購自雅安農(nóng)貿(mào)市場。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基:胰蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，加水溶解后定容至1 000 mL，調(diào) pH 7.0 ±0.1，121℃滅菌15 min。

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基:每1 L培養(yǎng)基中加入酵母提取物3 g、蛋白胨7 g、3號膽鹽1.5 g、NaCl 5 g、乳糖10 g、中性紅 30 mg、結(jié)晶紫2 mg、瓊脂15 g、pH 7.5，121℃滅菌 15 min。

1.2 方法

1.2.1 泡菜中細菌和大腸桿菌的分離計數(shù)

在無菌條件下從發(fā)酵泡菜壇中取發(fā)酵菜鹵10 mL轉(zhuǎn)入90 mL無菌生理鹽水(0.85%NaCl)中，制備10－1～10－6的稀釋液。用傾注法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù)，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后計數(shù)。待長出明顯菌落后，從平板上挑取單菌落，平板劃線多次純化。

1.2.2 發(fā)酵初期亞硝酸鹽含量的測定

測定0～5 d泡菜中亞硝酸鹽的含量。

1.2.3 硝酸鹽還原菌株的篩選

將純化的微生物接種到含有NaNO3的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2天后測定NaNO3消耗量和NaNO2含量。

1.2.4 硝酸鹽、亞硝酸鹽的測定

硝酸鹽測定采用紫外分光光度法［6］。稱取蘿卜勻漿20 g置于250 mL錐形瓶中，加入5 mL氨緩沖液，90 mL蒸餾水，2 g粉末狀活性炭，振蕩30 min，將樣液移入250 mL容量瓶中，加亞鐵氰化鉀和硫酸鋅溶液各2 mL，定容至刻度，搖勻，靜置10 min后過濾。取濾液10 mL于50 mL容量瓶中，加入8 g/L氨基磺酸溶液0.1 mL，搖勻，再加入1.0 mol/L HCl 1.0 mL定容至刻度。于紫外分光光度計上測定溶液在220 nm和275 nm處的吸光度。

亞硝酸鹽測定采用鹽酸萘乙二胺法［7］。稱取5g(精確至0.01 g)制成勻漿的試樣，置于50 mL燒杯中，加12.5 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以70℃左右的水約300 mL將試樣洗入500 mL容量瓶中，于沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻。加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各5 mL，并加入0.4 g活性碳，用純水定容至刻度，搖勻。靜置30 min后過濾。吸取吸取40 mL上述濾液于50 mL帶塞比色管中，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm比色皿，以零管調(diào)零，于波長538 nm處測吸光度，繪制標準曲線比較。同時做試劑空白。

1.2.5 革蘭氏染色

挑取單菌落進行革蘭氏染色，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌，細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色(紅色)的細菌為革蘭氏陰性菌。

1.2.6 接觸酶

挑取單菌落直接滴加3%的H2O2，有氣泡產(chǎn)生者為接觸酶陽性，無氣泡為陰性。

1.2.7 菌種的鑒定

以16S rDNA保守序列作為分子標記，引物采用通用引物 27F-1492R，正向 F1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反 向 F2:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系:上游與下游引物各5 μL，dNTP5 μL，Taq 酶 0.5 μL，10 × PCR buffer 5 μL，加無菌水至50 μL。挑取單菌落為模板加入PCR體系。PCR反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸 45 s，72℃ 終延伸 10 min，循環(huán)30次。4℃保存。取10 μL PCR產(chǎn)物上樣進行電泳。電泳緩沖液為0.5×TBE，恒流20 mA電泳40 min。結(jié)束后用EB染色15 min，紫外光凝膠成像，進行結(jié)果分析。菌株16S rDNAPCR產(chǎn)物測序由北京華大公司完成，測序結(jié)果與Genbank的序列進行比對。

1.2.8 硝酸鹽還原菌中硝酸還原酶活力測定［8］

菌體制備:將硝酸鹽還原菌接種于液體培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18 h。菌液離心(5 000×g，4℃，25 min)，棄去上清液，得到下面的沉淀，即菌體。

粗酶液的提取:菌體中加入20mL提取緩沖液(5 mmol/L EDTA，5 mmol/L半胱氨酸，25 mmol/L的磷酸緩沖液，pH 7.6)，超聲波破碎，離心，上清液即為粗酶提取液。

酶活力的測定:取 2 mL粗酶提取液，1 mL NaNO3(100 mmol/L)，6 mL磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L，pH 7)混合，再加入1 mL的新配制的NADH溶液(2 mg/mL)。30℃反應30 min。將分析液移入沸騰的5 mL 0.3 mol/L的ZnSO4溶液中，煮沸1 min，然后冷卻至室溫。加入2 mL l mol/L的NaOH，室溫下離心。取3 mL上清液，加入3 mL磺胺(1%)配置于3 mol/L HCl)和3 mL 0.05%(m/V)的N-1萘基乙二胺溶液。3℃下靜置30 min。于波長540 nm處測吸光度，和標準曲線對照得出亞硝酸鹽濃度。由此得到的亞硝酸鹽濃度換算成硝酸還原酶活性大小。

1.2.9 pH對酶活力的影響

將酶液分別與0.1 mol/L，pH 3.0～7.5的磷酸緩沖液等量混合，測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌和大腸桿菌與亞硝酸鹽的變化

采用平板計數(shù)培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基對發(fā)酵泡菜中細菌和大腸桿菌進行計數(shù)。如圖1所示，在發(fā)酵過程中，細菌數(shù)量第2天就達到了107CFU/mL，大腸桿菌達到了104CFU/mL，此時亞硝酸鹽的含量也最高，隨著發(fā)酵的進行，亞硝酸鹽含量逐漸下降，細菌和大腸桿菌的數(shù)量也逐漸減少。

圖1 發(fā)酵初期細菌和大腸桿菌數(shù)量與亞硝酸鹽的變化

2.2 硝酸鹽還原菌的篩選及還原能力測定

采用2種不同培養(yǎng)基從發(fā)酵蘿卜中分離出10個菌株，對它們進行還原能力測定。如圖2、圖3所示，9個液體培養(yǎng)基中硝酸鹽含量減少，亞硝酸鹽含量增加，說明接種的9個菌株都具有硝酸鹽還原能力，其中E5、E6硝酸鹽還原能力最強，其次是D1、D2。D3無硝酸鹽還原能力。因此選擇E5、E6作后續(xù)實驗。

圖2 各菌株亞硝酸鹽生成量

圖3 各菌株剩余的硝酸鹽含量

2.3 菌落形態(tài)分析

從發(fā)酵蘿卜中篩選出2個硝酸鹽還原能力較強的菌株E5、E6。經(jīng)分離純化后，觀察平板上的菌落形態(tài)見圖4，菌落特征見表1。

表1 E5、E6的菌落形態(tài)

圖4 E5和E6的菌落形態(tài)

2.4 革蘭氏染色

對分離的2株硝酸鹽還原菌進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征見圖5，兩者均為革蘭氏陰性菌。

圖5 E5(左)和E6(右)菌體形態(tài)特征及革蘭氏染色(10×100)

2.5 接觸酶

E5和E6滴加H2O2后不產(chǎn)生氣泡，接觸酶反應均為陰性。

2.6 分子生物學鑒定

E5與E6號菌株的16SrDNA序列測定結(jié)果與GenBank中的序列比對并進行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，表明E5(HM162426.1)與陰溝腸桿菌同源性最高，相似度為98%，E6(GQ496663.1)與克雷伯氏菌同源性最高，相似度為97%。

圖6 根據(jù)16S rDNA序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 根據(jù)16S rDNA序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹

結(jié)合E5與E6的菌落形態(tài)、菌體特性、革蘭氏染色及接觸酶反應，最終確定2株菌分別為Enterobacter cloacae和 Klebsiella oxytoca。

2.7 硝酸還原酶活的測定

菌株E5、E6的硝酸還原酶活力分別為1.64和1.79。

2.8 pH值對硝酸還原酶的影響

由圖8可知，隨著pH的增大，硝酸還原酶酶活逐漸增大，pH 3～4.5時酶活比較低，pH 5～6.5酶活較高，pH 5.5時酶活最高。因此，pH 5.5為硝酸還原酶的最適pH。Klebsiella oxytoca硝酸還原酶活力比Enterobacter cloacae高。

圖8 pH對硝酸還原酶的影響

3 結(jié)論

通過分析亞硝酸鹽含量與細菌、大腸桿菌數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽含量、細菌、大腸桿菌的變化趨勢基本一致，亞硝峰出現(xiàn)在發(fā)酵的第2天，此時細菌和大腸桿菌數(shù)量分別達到了107CFU/mL和104CFU/mL。隨著發(fā)酵的進行，亞硝酸鹽含量和細菌、大腸桿菌數(shù)量逐漸減少。這可能與微生物中硝酸還原酶有關(guān)。目前，對于蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的形成，大多數(shù)人認為起作用的是具有硝酸鹽還原能力的微生物，少部分人認為是蔬菜組織中硝酸還原酶將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽引起的。關(guān)于亞硝酸鹽形成的原因還有待進一步的研究。

硝酸鹽還原對于整個氮素循環(huán)極為關(guān)鍵。從發(fā)酵蘿卜中分離出9個菌株均具有硝酸鹽還原能力，其中2個菌株有較高的硝酸鹽還原能力，經(jīng)分子生物學鑒定，分別為Enterobacter cloacae和Klebsiella oxytoca。

經(jīng)過對不同pH條件下硝酸還原酶活性的研究，確定pH 5.5為2個菌株硝酸還原酶的最適pH。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液pH逐漸降低，亞硝酸鹽含量也逐漸減少，有研究發(fā)現(xiàn)pH 4.5以下能夠抑制硝酸還原酶酶活，抑制了亞硝酸鹽的生成［5］。Klebsiella oxytoca硝酸還原酶酶活力高于Enterobacter cloacae。說明Klebsiella oxytoca硝酸鹽還原能力比Enterobacter cloacae強。

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