GC-FID測定黃酒中17種游離氨基酸*

李國輝，鐘其頂，高紅波，熊正河，肖冬光

1(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

黃酒營養最豐富，富含各類氨基酸，其氨基酸主要來自原料及微生物的代謝作用，氨基酸種類及含量高低是評價黃酒風味和營養質量的一項重要指標［1］。

氨基酸的檢測方法有顯色法［2］、氨基酸自動分析儀法［3］、高效液相色譜法［4］和毛細管電泳法［5］。目前，采用氣相色譜分離檢測氨基酸的方法在國際上已有報道［6－8，10－12］，在穩定同位素標記的黃酒氨基酸代謝流分析中，由于同位素質譜儀與液相色譜聯機局限性，基于液相分離的黃酒氨基酸無法注入穩定同位素質譜儀測定。因此，開發一種基于氣相色譜分離檢測氨基酸的方法具有重要現實意義。

采用氣相色譜分離的氨基酸檢測方法需將氨基酸轉化為非極性易揮發的衍生物，衍生方法主要包括:硅烷化、酯化和酰化等。其中硅烷化反應具有一步加熱反應完成，反應條件相對溫和、快速，操作簡便，衍生樣品可直接進行儀器分析等優點。目前用于甲基硅烷化反應的衍生試劑主要有N，O-雙三甲硅烷基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)、N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)及N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氯乙酰胺(MTBSTFA)反應形成叔丁基二甲基氯硅烷(TBS)衍生物［13］。而MTBSTFA在分析化合物特征離子及穩定性方面更優于BSTFA［14］。衍生原理如下:在氨基酸的氨基和羧基端分別連接-TBDMS基團，經高溫裂解之后，部分化學鍵將沿圖1所示的虛線處斷裂，測定氨基酸特定基團R［15］。

圖1 MTBSTFA衍生氨基酸產物及其斷裂位點

本研究建立了一種以MTBSTFA為衍生試劑檢測黃酒中主要游離氨基酸的GC-FID方法，為建立氣相-燃燒-同位素比率質譜(GC-C-IRMS)測定黃酒中氨基酸13C穩定同位素豐度檢測方法和黃酒氨基酸穩定同位素代謝流分析奠定了基礎。

1 材料方法

1.1 儀器

氣相色譜儀(Agilent 6890，Agilent Technologies公司)，氫離子火焰檢測器，高效液相色譜儀(waters 2695，Waters公司)，恒溫水浴鍋(Thermo star-95)，氮吹儀(MTN-2800D)，分析天平(Mettler Toledo AB204-N)等。

1.2 試劑

氨基酸標準品(Waters公司)，衍生試劑N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(≥95%，購自Sigma–Aldrich公司)，輔助衍生試劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙腈(ACN)為國產色譜純。

1.3 氨基酸標準工作液

分別準確稱取各氨基酸標樣0.100 0 g，用0.1 mol/L HCl定容至100 mL，4℃保存，作為標準儲備液。使用時稀釋，分別設置50～500mg/L不同的濃度梯度。

1.4 衍生條件

取一定濃度的氨基酸標準液50 μL置于2 mL進樣瓶中，氮吹儀下40℃吹干。加入100 μL輔助衍生試劑DMF和100 μL衍生試劑 MTBSTFA，80℃反應60 min，反應完成后冷卻至室溫，待測。

1.5 色譜條件

DB-5毛細管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，Agilent Technologies);載氣為氮氣;柱流速1 mL/min;進樣口溫度250℃;升溫程序為:起始溫度120℃，保持2 min，，保持10 min;進樣體積1 μL;分流比 20∶1。

1.6 標準曲線

取50～500 mg/L的氨基酸標準液50 μL，氮吹儀下40℃吹干，加入衍生試劑和輔助衍生試劑，80℃衍生，60 min。冷卻至室溫后進行GC-FID檢測。

1.7 樣品測定

取4℃下10 000 r/min離心10 min后的黃酒上清液50 μL，氮吹儀下40℃吹干。按上述1.4條件衍生，衍生后0.22 μm微孔濾膜過濾，冷卻至室溫待測。

1.8 回收率及精密度

取4℃下10 000 r/min離心10 min后的黃酒上清液50 μL，加入不同濃度的各氨基酸標準液，按1.7方法處理。分別衍生處理5次，計算RSD值。

1.9 HPLC法測定黃酒中氨基酸含量

方法見文獻［16］。

2 結果與分析

2.1 氨基酸衍生條件優化

衍生反應的效率與反應條件密切相關，部分文獻報道氨基酸標準液使用純水配制較使用0.1 mol/L HCl配制時谷氨酸和絲氨酸的衍生效果會稍有提高［17］。但是由于黃酒自身的微酸性性質，本實驗不討論純水與0.1 mol/L HCl對衍生效率的影響。主要從反應溫度、時間和試劑對衍生效果進行比較優化。

分別選取谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)和賴氨酸(Lys)作為參考氨基酸。其中各氨基酸的峰面積加和表示衍生效率。分析結果顯示在不同衍生條件下DMF的輔助衍生效果均優于ACN(圖2)。

圖2 不同時間和溫度下ACN和DMF輔助衍生效率比較

由圖3可知，使用DMF輔助衍生試劑在80℃反應60min時，衍生效果最好。綜合各項條件，選用DMF為輔助衍生試劑，在80℃、60 min條件下進行衍生，且各氨基酸衍生峰分離度良好(圖4)。

圖3 不同衍生條件下DMF輔助衍生效率比較

圖4 氨基酸經MTBSTFA衍生GC-FID分析圖譜

2.2 準確性和回收率

采用上述衍生條件，分別以各種氨基酸峰面積y對各氨基酸含量x(mg/L)作線性回歸。各回歸方程的相關系數R2除脯氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸為0.98外，其余氨基酸均大于0.99，相關性良好;LOD(3S/N)為0.61～7.13 mg/L(見表1)。

取同一黃酒樣品衍生后，連續測定5次，RSD在0.4% ～2.9%之間，方法重復性良好。

樣品加標回收實驗結果表明，除精氨酸外，黃酒中氨基酸加標回收率在87.11%～119.47%之間;RSD為0.5% ～4.6%(n=5)，滿足黃酒中微量氨基酸含量準確測定要求。由圖4A和4B可見，在一定濃度下精氨酸與衍生試劑結合后所獲得FID信號較弱。分析其原因，精氨酸與主鏈最接近的旁鏈部分較長、而另一端的旁鏈則是一個胍基。胍基的酸度系數(PKa值)為12.48，在中性、酸性或堿性的環境下都帶正電荷。在其雙鍵及氮孤立電子對之間的共軛體系，使得胍基能形成多重的氫鍵。進而在與衍生試劑結合之后R基團不易斷裂。

表1 17種氨基酸的線性方程及相關系數

表2 樣品加標回收率

同一黃酒樣品分別通過GC-FID和HPLC-UV檢測分析，測定結果基本一致(見表3)。經SPSS雙變量相關分析，皮爾遜相關系數R為0.998(見表4)，表明本方法與成熟的HPLC方法具有可比性，且準確性較高。

表3 不同方法對黃酒中氨基酸檢測結果比較

表4 GC-FID與HPLC測定結果相關性分析

2.3 GC-C-IRMS初步測定

利用GC-FID的衍生和測定條件，使用 GC-CIRMS對氨基酸衍生樣品進行初步測定，如圖5所示。17種氨基酸均出峰，且分離度良好，可有效測定各氨基酸穩定碳同位素比值(δ13C)。

圖5 氨基酸衍生物中δ13C經GC-C-IRMS分析譜圖

3 結論

本研究建立以MTBSTFA為衍生試劑，測定黃酒中17種游離氨基酸的GC-FID方法。該方法操作簡便、準確、重現性好，適合黃酒中游離氨基酸的定量分析;基于氣相分離原理，為今后開發GC-C-IRMS測定黃酒中氨基酸同位素方法奠定了良好基礎。

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