低氧濃度改變對神經干細胞增殖分化及HIF-1α表達的影響＊

湖北醫藥學院人體解剖教研室（十堰442000）

馮 娜 彭興春 賀細菊 戴冀斌△▲ 張 濤△

材料與方法

1 實驗材料 與試劑DMEM／F12培養基（武漢博士德）；特優級胎牛血清 FBS（Sig ma）；B27（Gibco）；bFGF（Peprotech）；胰酶、左旋多聚賴氨酸（Sigma）。抗體：鼠抗人anti-nestin（1∶100）（Sigma），anti-神經元特異性烯醇酶NSE（Sigma），anti-GFAP的單克隆一抗及相應的熒光標記二抗（Sigma）；兔抗鼠HIF-1α（1∶100）（武漢博士德），羊抗兔FITC熒光標記二抗（武漢博士德）；DNA分子Marker（Fer mentas）；TRIzol試劑（Promega）；c DNA試劑盒（MBI）；T aq酶（Biostar）。

2 實驗方法

2.1 神經干細胞的體外培養、增殖與分化 實驗動物：E12～14 d昆明小鼠（SPF級），武漢大學醫學院實驗動物中心提供。參照徐進等［8］的方法體外培養E12～14 d胚鼠大腦皮質部分NSCs。將培養5～7 d的神經球以每平方厘米20～30個細胞球接種于置有預先經PLL包被蓋玻片的24孔培養板中，加入含10%FBS的DMEM／F12（不加任何生長因子）誘導分化。每2～3 d換液1次，觀察比較并記錄。

2.2 實驗分組及低氧模型的建立 對照組：常氧（20%O2）組；實驗組：低氧10%O2組。每組又分為低氧1 d、低氧3 d和低氧5 d組，細胞低氧時間從原代培養第1天開始計算。低氧模型為一有進、出氣孔的密閉容器，通入含5%CO2，3%O2和92%N2平衡的混合氣體，維持飽和濕度，置于37℃常規培養箱中。

2.3 熒光免疫細胞術鑒定 對神經球進行鼠抗Nestin、鼠抗HIF-1α免疫細胞化學染色，對分化12～14d細胞進行鼠抗NSE，鼠抗GFAP免疫細胞化學染色。

2.4 RT-PCR檢測HIF-1αmRNA的表達 采用TRIzol法提取總RNA，使用Pri mer 5.0軟件分析設計引物，得到小鼠HIF-1α及參照β-actin的引物序列：HIF-1α的上游引物序列為5-TCCAAGCCCTCCAAGTATGA-3’，下游引物序列為5’-TGCCTTAGCAGTGGTCGTTT-3’，擴增產物長度這202bp。βactin上游引物序列為5’-ATAAACCTGGCAATTGTC-3’，下游引物序列為5’-CCTGAGTTGAAAATGGAT-3’，擴增產物長度為280bp。RT-PCR條件：按照逆轉錄試劑盒說明操作，反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性50 s，54℃退火60 s，72℃延伸60s，共35個循環；72℃總延伸10 min；RT-PCR產物以2%瓊脂糖電泳，目的基因表達強度以Rv＝V（目的基因）／V（β-actin）的比值表示。

2.5 流式細胞術測定神經元分化率 取誘導分化10～12d的細胞，加入0.2%EDTA消化10～20 min，甲醇-20℃ 固 定20 mi m，PBS 沖 洗。1%Triton-100透化25 min，離心棄上清，加入抗NSE一抗，4℃過夜，PBS漂洗后加入FITC標記二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗兩次后稀釋細胞，400目尼龍網過濾，制成單細胞懸液，在流式細胞儀上測定1萬個細胞，記錄其中熒光標記細胞數及百分比。

3 統計學處理 本組用SPSS17.0軟件處理數據，實驗結果以均數±標準差（±s）表示，對于不同氧濃度的指標采用方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 低氧與常氧條件下NSCs體外培養 增殖早期（培養1～2d時）：初期取材的NSCs光鏡下呈圓形，透亮且飽滿。接種初期NSCs光鏡下呈單個均勻散在分布，懸浮生長，圓形，透亮；2d左右可見數個至數十個細胞的聚集體，周邊界線清晰，整個聚集體折光性好，以后聚集體增大，亦懸浮生長，形成神經球（Neur osphere）。低氧增殖3d的神經球直徑可達120～200μm，均明顯高于常氧組，且10%O2低氧組的神經球數目明顯增多（見圖1）。低氧5d，3%O2組神經球表面有少量細胞脫落的現象。高倍鏡下10%O2組細胞脫落情況好于3%O2組，但兩組神經球總體狀況均良好。分化期：神經球在誘導分化條件下數小時內貼壁，12h左右可見短小突起從神經球內伸出；2d左右有細胞沿著長突起向外遷移；分化6～7d后可見大量細胞向外遷移并分化，體積較小的神經球大部分分化為神經元或神經膠質細胞，較大的神經球內部可見有等待分化的干細胞（見圖2）。分化10～12d后神經球可完全分散呈單個細胞，突起呈雙極或多極狀，和鄰近神經球或細胞伸出的突起連接，呈網絡狀。與常氧對照組相比，低氧組神經球向外分化速度較快，突起較多，隨低氧時間的延長，形成的網絡更為密集。

2 熒光免疫細胞術鑒定結果 增殖期神經球：可見Nestin陽性細胞，Nestin蛋白主要表達于細胞質中；各低氧組中B組和C組細胞呈HIF-1α陽性，HIF-1α蛋白主要表達于胞質中，其余HIF-1α為陰性。分化10d細胞：可見NSE與GFAP陽性細胞細胞，低氧組細胞突起較多，與相鄰細胞或神經球建立更為廣泛的突觸聯系（見圖3）。

3 RT-PCR結果 見圖4～5。各組均出現預期mRNA擴增條帶，且表達豐度均高于對照組。3%O2組HIF-1αmRNA的相對表達量分別為0.41±0.03，0.74±0.01，0.81±0.02，進行性增強，與對照組（0.23±0.02）相比具有顯著性差異（P＜0.05），3d組與5d組間無顯著性差異（P＞0.05）。10%O2各組HIF-1αmRNA的相對表達量分別為0.34±0.02，0.62±0.01，0.89±0.02，與對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

4 流式細胞術檢測NSE陽性神經元 見附表。各低氧組NSE陽性神經元增高與常氧對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 培置3d NSCs倒置相差顯微鏡 （×100）A示常氧；B示3%O2；C示10%O2

圖2 分化7d NSCs倒置相差顯微鏡（×100）A示常氧；B示3%O2；C示10%O2

圖3 免疫細胞化學染色不同抗原的表達A為nestin陽性細胞（×100）；B為HIF-1α陽性神細胞（×100）；C為NSE陽性細胞（×400）；為D GFAP陽性細胞（×400）

附表 各組NSE陽性神經元占全部細胞的比值（±s，%，n＝4）

附表 各組NSE陽性神經元占全部細胞的比值（±s，%，n＝4）

注：與對照組比較，＊P＜0.05

組 別 3%O2組 10%O2組對照組17.90±0.46 1d組 24.04±0.23＊ 21.54±0.19＊3d組 32.60±0.41＊ 30.61±0.44＊5d組 34.02±0.58 41.09±0.61＊

圖4 3%O2組各HIF-1αmRNA的PCR產物凝膠電泳

圖5 10%O2各組H IF-1αmRNA的PCR產物凝膠電泳

討 論

2000年，Morrison等［1］發現了3%O2能促進胎鼠神經嵴干細胞、中腦、紋狀體及皮質等部位的中樞神經系統前體細胞的增殖。Tonchev等［2］研究了成年猴全腦缺血后細胞增殖情況，他們發現全腦缺血20 min后，在海馬部位增殖細胞的數量顯著增多。在體研究與離體研究結果相符，張翠萍等［3］也報道了輕中度低氧能促進胎鼠中腦NSCs的體外增殖。我們的實驗室研究也發現：3%O2能促進NSCs向神經元分化，同時能提高TH陽性神經元的比例［4］。HIF-1由α、β兩個亞基組成，HIF-1α既是HIF-1調節亞基，又是活性亞基。大量研究表明：HIF-1已成為低氧應答時基因表達和恢復細胞內環境穩定的調節中心。低氧引起HIF-1α轉錄水平的增加后，作用于一系列靶基因［5］，包括：EPO、i NOS、VEGF、酪氨酸脫羧酶和糖酵解基因等，參與無氧代謝、紅細胞生成、血管形成和呼吸等低氧應答反應，提高細胞對低氧的耐受能力。Turcotte等［6］研究發現，人腎癌細胞系Caki細胞在1%O2條件下培養2h HIF-1αmRNA表達即開始增加，一直到低氧72h仍能檢測到 HIF-1αmRNA的高表達，其表達豐度約為常氧組的3倍。Hayashi等［7］在體外培養的滋養層細胞上也觀察到了同樣的結果。

本實驗研究結果顯示：隨低氧時間的增加，低氧組神經球密度及直徑均明顯高于常氧組，隨低氧時間的延長，球體密度增加不多，但球體細胞數增加，甚至出現了3%O2組中低氧5d組中因神經球細胞數目過多而導致折光性下降，內部細胞死亡的現象，這些結果均表明適度低氧能夠促進NSCs的體外增殖。在分化期，低氧組神經球向外分化速度較快，形成了更多的纖維聯系，從形態上顯示低氧有利于NSCs的生長與成熟。同時，RT-PCR結果顯示：NSCs在低氧條件下，低氧1d即可檢測到 HIF-1αmRNA的表達，且 HIF-1αmRNA的表達隨低氧時間增加而增加，10%O2組與3%O2組相比，低氧持續時間越長，10%O2組NSCs增殖量越大。本實驗研究結果還顯示：NSCs具有多向分化的潛能性，可分化為神經元及神經膠質細胞，而低氧條件下，實驗組NSE陽性神經元的比率也明顯高于對照組，10%O2組與3%O2組相比，低氧持續時間越長，10%O2組中NSE陽性神經元的比率越大。

本實驗中所設置的兩個低氧組為3%O2和10%O2。最早的關于低氧的研究就是從3%O2入手的，有著較多的理論依據和支持。另外我們試圖找到更能促進神經干細胞表達HIF-1αmRNA的某個氧濃度或者濃度區間，于是我們借鑒了藥物半衰期T1／2這個概念，選擇了正常氧濃度的一半10%O2，并期望神經干細胞能在此濃度下平穩持續的表達HIF-1αmRNA，從而獲得更多的神經細胞。而實驗的結果也和預期的大致相同，在10%O2的低氧條件下，神經干細胞表達的HIF-1αmRNA持續且穩定。

由此可見，低氧、HIF-1α和細胞增殖之間存在著復雜的調控關系。低氧對HIF-1α的表達調控是多水平的。不同的低氧濃度對神經干細胞表達HIF-1αmRNA也有著密切的聯系。

［1］Morrison SJ，Csete M，Groves AK，etal.Culture in reduced levels of oxygen pro motes clonogenic sy mpathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells［J］.Neuroscience，2000，20（19）：7370–7376.

［2］Tonchev AB，Yamashi ma T，Zhao L，etal.Proliferation of neural and neuronal progenitors after global brain ischemia in young adult macaque monkeys［J］.Mol Cell Neurosci，2003，23（2）：292-301.

［3］張翠萍，趙 彤，朱玲玲，等.低氧對胎鼠中腦NSCs的促體外增殖作用［J］.基礎醫學與臨床，2006，26（5）：476-480.

［4］陸蔚天，戴冀斌，黃 娟.低氧條件下中腦神經干細胞向多巴胺能神經元的分化［J］.解剖學雜志，2006，29（4）：506-508.

［5］Ingram N，Porter C D.Transcriptional tar geting of acute hypoxiain the tumour stroma is a novel and viable strategy for cancer genet herapy［J］.Gene Ther，2005，12（13）：1058-1069.

［6］Turcotte S，Desrosiers RR，Beliveau R.HIF-1αmRNA and protein upregulation involves Rho GTPase expression during hypoxia in renal cell carcinoma［J］.J Cell Sci，2003，116（Pt 11）：2247-2260.

［7］Hayashi M，Sakata M，Takeda T，etal.Hypoxia up-regulates hypoxia-inducible factor-1 alpha expression through Rho A activation in tr ophoblast cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（3）：1712-1719.

［8］徐 進，戴冀斌，田毅浩，等.小鼠胚胎神經干細胞的分離培養及其鑒定［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2003，12（4）：429-432.