乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠酒精性肝病的保護(hù)作用研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（西安710004）

時(shí)代音△ 董 蕾 魯曉嵐

我國(guó)酒精性肝病患病率居高不下，加強(qiáng)對(duì)酒精性肝損傷的防治研究已成為當(dāng)前面臨的重要課題。酒精性肝病（Alcoholic liver disease，ALD）尚無特效的治療方法，治療上以戒酒和營(yíng)養(yǎng)支持為主。治療的藥物主要有甘草酸制劑、水飛薊賓類和多烯磷脂膽堿等，其確切療效報(bào)道不一。且有的藥物對(duì)于肝臟有著直接的損害作用。乙酰半胱氨酸 （N-acetylcysteine，NAC）現(xiàn)臨床主要用于治療呼吸系統(tǒng)疾病，同時(shí)其靜脈和口服制劑用于醋氨酚中毒所致的肝損害解毒。本組通過酒精灌胃法建立慢性酒精性肝損傷大鼠模型，觀察乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠血清ALT、AST、SOD、MDA以及病理變化影響，探討乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

材料與方法

1 動(dòng)物與分組 選擇健康6周齡大鼠40只，體重200±10g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組：酒精性肝病模型組（模型組）：15只；酒精性肝病模型+乙酰半胱氨酸干預(yù)組（治療組）：15只；對(duì)照組：10只。

2 藥物與試劑 乙酰半胱氨酸（批號(hào)：28001959）由Zambon SPA提供；50%酒精、10%甲醛溶液、蘇木素染料、伊紅染料由上海試劑三廠提供。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測(cè)定試劑盒由上海科華生物公司提供；SOD和MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。SOD測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)比色法。

3 大鼠酒精肝模型的建立 大鼠在室溫22±1℃，濕度（50±5）%的實(shí)驗(yàn)室用平衡飼料喂養(yǎng)1周。模型組每日早、晚采用50%酒精（75%醫(yī)用酒精用生理鹽水配制）各灌胃1次，治療組每日在酒精灌胃的基礎(chǔ)上于午后給予乙酰半胱氨酸腹腔注射1次，300 mg／kg。模型組和治療組大鼠酒精用量第1周為每天8g／kg；第2周為每天9g／kg；第3周為每天10g／kg；第4周為每天11g／kg；從第5周開始以為每天12g／kg，正常對(duì)照組每日按模型組酒精用量的等體積生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均予以飲用水及全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)。

4 實(shí)驗(yàn)方法 12周后，3組各隨機(jī)取大鼠10只，左心室取血，測(cè)定血清ALT、AST、SOD、MDA值；取肝右葉組織lc m×lc m×lc m大小組織塊，行HE染色。

5 病理組織學(xué)檢查 參考有關(guān)文獻(xiàn)［1］，采用半定量法判斷脂肪變性及酒精性肝炎的炎癥活動(dòng)度，其具體記分方法：0分：為0期0級(jí)，無脂肪樣變及炎癥改變；1分：為1期1級(jí)，脂肪變性面積小于30%，伴局灶樣變性，少數(shù)有小壞死灶；2分：為2期2級(jí)，脂肪變性面積大于30%，伴氣球樣變；3分：為3期3級(jí)，脂肪變性面積大于50%，變性壞死嚴(yán)重，出現(xiàn)橋接壞死；4分：為4期4級(jí)，脂肪變性面積大于75%，損傷廣泛。

結(jié) 果

1 各組動(dòng)物血清ALT、AST、MDA和SOD水平的比較 見表1。模型組大鼠血清ALT水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），血清AST水平也有所升高（P＜0.01）；治療組血清ALT、AST水平較模型組顯著降低（P＜0.01）。同時(shí)模型組血清SOD水平較對(duì)照組顯下降（P＜0.01），血清 MDA水平顯著升高（P＜0.01）。治療組血清SOD水平較模型組明顯升高（P＜0.01），血清 MDA水平顯著下降（P＜0.01）。

表1 各組血清ALT、AST、MDA和SOD水平比較（±s）

表1 各組血清ALT、AST、MDA和SOD水平比較（±s）

注：﹡模型組與正常對(duì)照組相比較，P＜0.01；﹡﹡模型組與治療組比較，P＜0.01

組 別 n ALT（U／L）AST（U／L）MDA（μmol／L）SOD（μ／mL）對(duì)照組10 48.9±12.3 147.3±15.6 8.2±1.2 278.3±7.6模型組 15 76.5±8.7﹡ 188.1±24.2﹡ 20.6±3.6﹡ 196.1±24.3﹡﹡治療組 15 49.4±9.6﹡﹡ 150.6±26.9﹡﹡ 8.9±1.4﹡﹡ 279.9±7.9﹡﹡

2 各組肝組織病理分級(jí)及半定量計(jì)分 見表2。模型組病理評(píng)分為1.00±0.41分，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），治療組病理評(píng)分為0.05±0.48分，顯著低于模型組（P＜0.01）。

表2 各組肝組織病理分級(jí)及半定量計(jì)分

3 肝臟病理學(xué)檢查 見圖1～3。對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈大而壁薄，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細(xì)胞呈多邊形，胞漿豐富紅染，未見空泡變性及脂滴，胞核形態(tài)、染色正常；模型組中央靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松化，肝細(xì)胞溶解壞死，胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，以大泡性脂滴為主，伴有小泡性脂滴，呈中至重度脂變，甚至出現(xiàn)脂滴融合，伴淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；治療組見少量肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松化，個(gè)別胞漿中出現(xiàn)脂滴，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 對(duì)照組大鼠肝組織細(xì)胞圖（HE×200）

圖2 模型組大鼠肝組織細(xì)胞圖（HE×200）

圖3 治療組大鼠肝組織細(xì)胞圖（HE×200）

討 論

酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前還沒有完全清楚，一般認(rèn)為與酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的毒性作用、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、內(nèi)毒素、以及病毒的疊加、遺傳等多種因素有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠以酒精灌胃12周后，血清ALT、AST顯著升高，而治療組血清ALT、AST明顯低于模型組。同時(shí)病理切片提示：乙酰半胱氨酸治療組大鼠脂肪變性和炎癥程度明顯輕于模型組，表明：乙酰半胱氨酸能明顯抑制酒精引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

ALT、AST是反映肝細(xì)胞損害的比較靈敏的檢查指標(biāo)［2］。本研究中大鼠酒精灌胃后轉(zhuǎn)氨酶上升，以ALT、AST水平普遍高于正常對(duì)照組，提示：酒精灌胃大鼠出現(xiàn)了不同程度肝細(xì)胞損害；而經(jīng)乙酰半胱氨酸干預(yù)的大鼠，其AST、ALT水平低于酒精模型組。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種療效良好而且安全的呼吸道感染用藥（祛痰劑）。研究顯示：NAC作為一種巰基供給體，除具有上述作用外，還具有干擾自由基生成、清除已生成的自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝活性、預(yù)防DNA的損傷、調(diào)整基因的表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、抗細(xì)胞凋亡、抗血管生成、抑制惡性腫瘤發(fā)展、抑制新生物的生成和轉(zhuǎn)移等作用［3］。

文獻(xiàn)表明：還原型谷胱甘肽是肝細(xì)胞內(nèi)主要的水溶性抗脂質(zhì)過氧化物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)巰基類化合物的氧化和還原反應(yīng)，參與DNA蛋白質(zhì)的合成。在正常狀態(tài)下，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是體內(nèi)不飽和脂肪酸在自由基和金屬酶類作用下，所發(fā)生的一系列過氧化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清顯著低于乙酰半胱氨酸治療組，提示乙酰半胱氨酸作為小分子物質(zhì)，易進(jìn)入細(xì)胞，脫酰基后成為谷胱甘肽合成前體，促進(jìn)谷胱甘肽的合成。當(dāng)大鼠酒精性肝損傷時(shí)，體內(nèi)還原型谷胱甘肽急劇減少，而乙酰半胱氨酸提高組織內(nèi)谷胱甘肽含量，增強(qiáng)組織抗自由基及藥物和毒物損傷能力。這可能是因?yàn)镹AC能提供活性的巰基，抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，使局部組織的谷胱甘肽水平增高，從而發(fā)揮抗氧化作用［4］。

氧自由基在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。SOD能催化氧自由基歧化反應(yīng)，清除自由基，使細(xì)胞免受損傷。SOD可催化O2-生成O2和H2O2，H2O2則由谷光甘肽過氧化酶（CSH-PX）進(jìn)一步催化，變成O2和H2O2，從而防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化。SOD水平的高低是衡量機(jī)體對(duì)抗氧自由基能力大小的重要因素［5］，而 MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出的反應(yīng)性醛，是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量的高低可反映肝損傷程度的大小［6］。本實(shí)驗(yàn)中乙酰半胱氨酸干預(yù)組動(dòng)物血清SOD水平較模型組明顯升高，血清MDA水平降低，說明乙酰半胱氨酸可以清除自由基，降低氧化應(yīng)激水平。

乙酰半胱氨酸含有還原性巰基可直接捕獲未成對(duì)的電子，阻遏超氧陰離子的生成和還原性巰基作為GS H-PX的底物，清除具有組織損傷能力的羥自由基和脂肪酰羥基過氧化物，明顯減少M(fèi)DA，從而緩解由乙醇引起的毒性作用。

另外，國(guó)外資料顯示乙酰半胱氨酸在體內(nèi)能形成亞硝基半胱氨酸，后者能改善血液動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)收縮的微循環(huán)血管擴(kuò)張，有效增加血液對(duì)組織的氧運(yùn)輸和氧釋放，糾正缺氧，防止肝細(xì)胞的壞死［7］。乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用與亞硝基半胱氨酸有關(guān)還需進(jìn)一步證實(shí)。

［1］張 宇，陳韶華.茶多酚治療慢性酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華肝臟病雜志，2005，13（2）：125-127.

［2］Niemela O，Parkkila S，Britton RS，etal.Hepatic lipid peroxidation in hereditar y hemochr omatosis and alcoholic liver injur y［J］.J Lab Clin Med，1999，133（5）：451-460.

［3］Zafarullah M，Li WQ，Sylvester J，etal.Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60（1 ）：6-20.

［4］Chen N，Aleksa K，Woodland C，etal.N-Acetylcysteine prevent s ifos famide-induced nephrotoxicity in rats［J］.Br J Phar macol，2008，153（7）：1364-1372.

［5］Kaplo witz N.Biochemical and cellular mechanis ms of toxic liver injury［J］.Semin Liver Dis，2002，22（2）：137-144.

［6］Martin AS，Delas H，Sanchez-Reus MI，etal.Phar ma-cological modification of endogenous antioxidant enzy mes by ursolic acid on car bon tetrachloride induced liver damager in rats and primary cultures of rat hepatocytes［J］.Exp Toxi-col Pat hol，2001，53（2～3）：199-206.

［7］Kawada N，Seki S，Inoue M，etal.Effect of antioxidants，resveratrol，quercetin，and N-acetylcysteine on the f unctions of cult ured rat hepatic stellate cells and kuffer cells［J］.Hepatology，2004，27（5）：1265-1274.