不同環氧合酶-2抑制劑治療大鼠腦外傷早期炎癥實驗觀察

河北省秦皇島市第一醫院神經外科二病區（秦皇島066000）

吳 磊 趙建華 馮 繼▲

腦外傷后的炎癥反應是腦組織持續性損傷的重要原因，針對早期炎癥反應的及時有效處理，會降低損傷程度，改善預后。COX-2是一種花生四烯酸代謝的限速酶，其產生的前列腺素和血栓素是腦創傷后患者發生炎癥級聯反應的重要介質之一［1］。近期研究表明：腦外傷早期伴隨炎癥反應的發生，腦組織中COX-2的表達常異常增高，且這種增高狀態持續越久，預后越不良［2］。有研究表明：COX-2在腦外傷早期可以大量生成，可能是導致患者損傷加劇的重要因素之一，通過抑制COX-2的產生，可以為治療腦創傷早期炎癥反應提供新途徑［3］。該研究就兩種COX-2抑制劑，選擇性抑制劑尼美舒利和非選擇性抑制劑吲哚美辛，進行平行比較試驗，并就其可能存在的機制予以淺顯分析。

材料與方法

1 動物與試劑 實驗動物選擇SD雄性大鼠96只，體重250±2g，清潔級，購于中國軍事醫學科學院實驗動物中心。尼美舒利由廣東省藥物研究所提供，吲哚美辛購自Gay man公司（英國）；COX-2引物由北京賽百勝公司合成，RT-PCR試劑盒由美國Qiagen公司生產；兔抗大鼠COX-2單克隆抗體由美國Santa公司生產；檢測PGE2含量的ELISA檢測試劑盒由上海太陽生物技術公司生產；Western-Blot化學發光試劑盒由美國Pierce公司生產。

2 動物與分組 將96只大鼠隨機分為對照組（不接受治療）、尼美舒利治療組和吲哚美辛治療組，每組32只。在打擊創傷后對照組的實驗動物仍然不接受任何治療；尼美舒利和吲哚美辛治療組分別按照6 mg／kg和25 mg／kg劑量每12h進行腹腔注射給藥1次。此后分別于實驗第24、48、72和96小時每組動物隨機處死8只，獲取鼠腦組織儲存備用。動物處死前對每只大鼠行神經功能缺損綜合評分，評分參照Reglodi等［3］的方法，每個時間點每只大鼠評測3次，每次間隔10 min，取算術平均值。

3 腦創傷模型的建立 以3.5 ml／kg體重對實驗大鼠進行腹腔麻醉后，充分暴露大鼠的顱骨，控制其以前囟后為2.0 mm、同時以中線右側2.0 mm為中心，以磨鉆在顱骨磨一直徑4 mm圓形骨窗，使硬膜保持完整，在骨窗邊緣進行固定打擊。將液壓顱腦創傷儀連接，使打擊管內部保持密閉，將峰值沖擊壓力控制為1.5～2.0at m、平均時程控制為23 ms沖擊致傷。

4 RT-PCR檢測COX-2 mRNA水平 提取大鼠腦組織的總RNA，在反轉錄酶進行轉錄后運行PCR循環反應。COX-2的引物序列是，上游5’-CCG CAG TAC AGA AAG TAT CAC-3’，下游 5’-ACA GCC CTT CAC GTT ATT G-3’，產物的大小大約為402bp。反應條件控制如下：94℃條件下3 min后連續運行45個循環，每個循環控制在94℃30 s、60℃45s、72℃30s。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析儀分析結果。

5 Wester n-Blot檢測COX-2蛋白水平 提取大鼠腦組織的總蛋白，采用Bradford法來測定其蛋白量。電泳后考馬斯亮藍染色，將蛋白轉到PVDF膜上，使用Wester n封閉液在37℃下進行2h封閉，在PBS漂洗后滴加1∶500稀釋的COX-2單克隆抗體在4℃下過夜，于第2日加入辣根酶標記的1∶500稀釋的二抗控制溫度為37℃保持2h。使用化學發光試劑盒顯影，通過Bio-Rad凝膠成像系統掃描光密度值，采用Quantity One軟件進行分析。

6 酶聯免疫吸附法檢測PGE2含量 將大鼠的每塊組織都放在含有1 ml含70%甲醇的離心管中。使用超聲破膜機將組織徹底勻漿，在冰上放置5 min可以使蛋白充分變性。在離心后棄掉上清液，在干燥機中將其干燥徹底，目的可以充分除去甲醇。使用1 ml的EIA緩沖液來溶解標本。操作要嚴格按照試劑盒說明使用EI ISA法檢測PGE2含量。

7 統計學處理 本組應用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 RT-PCR結果 見圖1。對照組的腦組織在大鼠傷后24 h COX-2 mRNA的水平明顯增高，至第3天達峰值，此后稍有下降；尼美舒利和吲哚美辛治療組與對照組同期比較，COX-2 mRNA水平明顯降低（P＜0.05），尼美舒利治療組COX-2 mRNA水平比吲哚美辛治療組更低，二者間有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 RT-PCR實驗顯示COX-2 mRNA的表達

2 Wester n-Blot結果 見圖2。與COX-2 mRNA表達趨勢保持一致，在大鼠腦創傷后COX-2的蛋白表達水平呈現出了明顯改變。尼美舒利和吲哚美辛治療組COX-2蛋白水平明顯低于對照組（P＜0.05），尼美舒利治療組COX-2蛋白水平比吲哚美辛治療組更低（P＜0.05）。

3 PGE2含量測定結果 見圖3。尼美舒利和吲哚美辛治療組與對照組同期比較，PGE2含量明顯降低（P＜0.05），尼美舒利治療組PGE2水平同吲哚美辛治療組比較，二者間無顯著性差異（P＞0.05）。

4 神經功能評分 見附表。與對照組同期比較，尼美舒利和吲哚美辛治療組實驗大鼠神經功能評分明顯優于對照組（P＜0.05）。兩治療組間大鼠神經功能評分比較無顯著性差異（P＞0.05）。

附表 兩種COX-2抑制劑治療后腦神經功能評分比較（±s，分）

附表 兩種COX-2抑制劑治療后腦神經功能評分比較（±s，分）

注：﹡與對照組比較，P＜0.05；△與尼美舒利比較，P＞0.05

對照組 34.19±2.37 18.91±1.83 17.13±1.71 16.04±1.47 15.09±1.91尼美舒利 35.27±2.46 16.32±2.03＊ 14.67±1.56＊ 12.75±1.52＊ 11.69±1.43＊吲哚美辛 36.09±2.97 17.28±2.08＊△ 16.07±2.05＊△ 12.11±1.32＊△ 10.99±1.06＊△

圖2 Wester n-Blot實驗顯示COX-2蛋白水平的表達

圖3 ELISA實驗顯示PGE2水平的表達

討 論

COX-2是一種重要的炎癥介質，在前列腺素的合成過程中起到了重要作用，是一種限速酶，其可將花生四烯酸有效轉化為血管活性的前列腺素前體物質，使氧自由基明顯增多，從而使得脂質過氧化，DNA損傷和細胞膜破壞加劇，減弱了血管內皮細胞的血管舒張反應性，造成了細胞損傷、代謝紊亂和血管機能障礙［4］。

COX-2在正常生理情況下含量極低，腦組織的COX-2主要存在于神經細胞膜［5］。COX-2本身并沒有強效的致神經損傷作用，但與COX-2活性密切相關的促炎性花生四烯酸產物是導致腦損傷持續性加重的主要原因之一。COX-2的酶解產物可以在至少3個環節上加重其腦損傷：脈管系統、血腦屏障和神經元本身［6］。血管收縮因子也是一種前列腺素，血栓素A 2（TXA2）是當前我國已知的一種血管收縮因子。前列腺素和多種白三烯可以促進其血腦屏障完全開放。選擇性COX-2可以作為一種抑制劑，使得尼美舒利能劑量依賴性地減少，同時還可以大幅減少腦缺血再灌注后的梗死體積，改善腦缺血后的神經缺陷，促進功能恢復，是腦缺血性損傷治療的有效藥物［7］。非選擇性COX-2抑制劑吲哚美辛是非甾體抗炎藥物的代表，在臨床和基礎研究中都被廣泛應用。但到目前為止，有關尼美舒利在腦外傷早期降低炎癥反應及其與非甾體抗炎藥物的療效比較，藥物作用機制等均未明確。

本研究利用大鼠腦損傷模型，對選擇性COX-2抑制劑尼美舒利和非選擇性COX-2抑制劑吲哚美辛在降低腦外傷早期炎癥反應程度方面進行比較研究。我們的結果顯示，尼美舒利在降低COX-2 mRNA水平和抑制COX-2蛋白質合成方面強于吲哚美辛，但在降低PGE2水平以及改善神經功能方面二者之間無顯著性差異。這一結果提示：選擇性COX-2抑制劑尼美舒利通過直接對COX-2 mRNA水平和（或）蛋白質合成的抑制作用，降低PGE2水平，進而抑制炎癥反應，降低損傷程度，提高神經功能評分；與此相對應，吲哚美辛降低COX-2 mRNA水平和（或）蛋白質合成方面明顯低于尼美舒利，但其降低PGE2水平和改善神經功能方面與前者比較無顯著性差異，提示吲哚美辛抑制腦外傷早期炎癥反應可能存在其它通路。

［1］Harris RE.Cyclooxygenase-2（cox-2）and the inflammogenesis of cancer［J］.Subcell Biochem，2007，42（1）：93-126.

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［3］Reglodi D，Tamas A，Lengvari I.Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Bull，2003，59（2）：459-466.

［4］張 堅，徐卓群，胡 強，等.選擇性環氧合酶2抑制劑對人膀胱癌細胞T24增殖和凋亡的作用［J］.癌癥，2007，26（4）：377-381.

［5］Terracciano S，Aquino M，Rodriquez M，etal.Chemistry and biology of anti-inflammatory marine natural products：molecules interfering with cyclooxygenase，NF-kappaB and other unidentified tar gets［J］.Curr Med Chem，2006，13（16）：1947-1969.

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［7］鄭 剛，張 進.COX-2抑制劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用研究［J］.福建醫藥雜志，2006，28（2）：103-105.