雷公藤甲素通過調節microRNA21的表達干預K562/A02細胞的化療敏感性

惠璐璐，許文林，沈慧玲，陳巧云，朱小蘭，龍璐璐，徐穎

(江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇鎮江212002)

MicroRNAs是1993年Lee等［1］在線蟲發育的研究中首先發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，長約21～24個核苷酸。它通過干擾mRNA的翻譯而下調靶基因的表達，能夠對基因表達進行微調，參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育、細胞增殖、細胞凋亡等［2］。近年來，越來越多的研究表明，microRNAs能夠影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［3］。有研究證明，抑制microRNA21表達能增強白血病細胞對化療藥物的敏感性［4］。

前期研究發現［5］，雷公藤甲素(triptolide，TPL)是從中藥雷公藤中提取的環氧化二萜內酯化合物，對K562/A02細胞中microRNA21表達有下調作用。本實驗旨在探討TPL提高K562/A02化療敏感性相關機制，為臨床白血病多藥耐藥的逆轉提供一條新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人慢性髓系白血病細胞株K562及其耐藥株K562/A02購于中科院上海細胞庫。K562細胞、K562/A02細胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培養液，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中常規培養，2～3 d換液1次，K562/A02細胞培養液中含多柔比星(doxorubicin，DOX)終濃度為 1.0 μg/ml以維持其耐藥性，實驗前脫藥培養2周，取對數生長期的細胞進行實驗。多柔比星為浙江海正制藥廠產品。噻唑藍(MTT)為Sigma公司。雷公藤甲素購自美國Sigma公司，RPMI1640培養基、胎牛血清均購自美國GibcoBRL公司。AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司。PI試劑盒購自Sigma公司，4℃保存。SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測TPL的細胞毒性 取對數生長期的細胞調整細胞濃度為2×105/ml，接種于96孔培養板，每孔加入細胞懸液200 μl，24 h后，設置調零孔，空白對照孔和加藥孔，每孔設3個復孔，置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養72 h，每孔加MTT 20 μl，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，終止反應。在酶聯免疫測定儀上檢測波長570 nm處光密度(D)值，分析TPL非細胞毒濃度。

1.2.2 TPL對K562/A02細胞多柔比星敏感性的影響 采用“1.2.1”MTT方法，檢測不同濃度多柔比星聯合TPL或單獨作用下，K562/A02細胞的存活率。為避免TPL自身誘導凋亡對實驗的影響，TPL采用非細胞毒濃度。實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 按 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。收集對數生長期細胞，以每孔5×105個接種于6孔板中，對照組給予3 μg/ml多柔比星，實驗組給予3 μg/ml多柔比星聯合TPL，作用24 h，棄培養基，4℃預冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心，1×106/ml的密度重懸細胞于100 μl的1×結合緩沖液中，加入5 μl AnnexinV和10 μl PI染液，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入300 μl上述緩沖液，于1 h內置流式細胞儀檢測。AnnexinV(+)/PI(－)為凋亡細胞，雙染色陽性為壞死細胞或凋亡晚期細胞。

1.2.4 熒光定量PCR檢測microRNA21表達 依據TRIzol試劑盒說明書，提取細胞內總RNA。以U6為內參，采用SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測細胞內microRNA21的表達水平［7］。實驗重復3次。

1.2.5 microRNA21模擬物及抑制劑轉染 microRNA21模擬物和抑制劑均由上海吉瑪制藥技術有限公司化學合成。microRNA21抑制劑的序列為5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3';microRNA21模擬物序列為5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。收集對數生長期K562及K562/A02細胞，以每孔4 ×105個接種于 6 孔板中，置 37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24 h，依據試劑盒說明利用脂質體2000分別將microRNA21模擬物、抑制劑轉染到K562和K562/A02細胞中。轉染24 h后，TRIzol法提取總RNA，熒光定量PCR檢測轉染后細胞中microRNA21的表達，并進行多柔比星藥物敏感度檢測;轉染72 h后，蛋白質印跡法檢測Bcl-2蛋白表達。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測Bcl-2蛋白水平 收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞2次，加入細胞裂解液，作用1 min，收集細胞裂解物10 000 r/min離心5 min，用Bio-Rad蛋白試劑盒測定濃度。等量蛋白(每孔25 μg)用12%SDS-PAGE電泳分離，100 V電轉2 h置硝酸纖維素膜，在含有0.1%Tween-20的5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h。Bcl-2和GAPDH一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發光試劑，攝影，對圖片進行灰度掃描。

1.2.7 統計學分析 實驗至少重復3次。SPSS12.0軟件進行統計分析，結果以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析和兩組資料比較的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TPL的細胞毒性作用

不同濃度的雷公藤甲素分別作用于K562和K562/A02細胞株72 h，MTT檢測活細胞數。從圖1可以看到，在 TPL濃度為 5 nmol/L時，TPL對K562/A02細胞的存活率沒有明顯影響。因此，采用5 nmol/L作為后續實驗的TPL濃度。

圖1 TPL對K562和K562/A02細胞的毒性Fig 1 Inhibition of triptolide to K562 and K562/A02 cell lines

2.2 TPL對K562/A02細胞多柔比星敏感性的影響

MTT實驗結果提示，相對于多柔比星單獨處理組，5 nmol/L TPL聯合不同濃度多柔比星作用于細胞72 h后，能夠明顯增強K562/A02細胞對多柔比星的敏感性(圖2A)。AnnexinV/PI雙染色定量檢測結果顯示5 nmol/L TPL聯合多柔比星作用與3 μg/ml多柔比星單獨作用相比，K562/A02細胞平均凋亡率由 4.3% 明顯上升到 18.5%(t=4.3，P ＜0.05)，見圖2B ～D。

圖2 TPL對K562/A02細胞多柔比星敏感性的影響Fig 2 Reversal of doxorubicin resistance in vitro by triptolide

2.3 TPL對 K562/A02細胞 microRNA21和 Bcl-2表達的影響

熒光定量 PCR檢測microRNA21表達水平，U6RNA作為內參;蛋白質印跡法檢測Bcl-2蛋白表達水平。結果顯示，5 nmol/L TPL作用后，K562/A02細胞中microRNA21、Bcl-2蛋白表達水平較未處理組明顯降低(t=5.12，P ＜0.05)，見圖 3。

圖3 TPL對K562/A02細胞株microRNA21及Bcl-2表達的影響Fig 3 Down-regulation of microRNA21 and Bcl-2 expression by triptolide

2.4 microRNA21對K562/A02細胞多柔比星敏感性的影響

為進一步證明microRNA21在白血病耐藥形成中的作用，分別將microRNA21模擬物和 microRNA21抑制劑轉染到K562和K562/A02細胞中，圖4A、4B顯示，轉染microRNA21模擬物能升高K562細胞microRNA21表達;而轉染了microRNA21抑制劑后，K562/A02細胞microRNA21表達明顯下降;轉染陰性對照(NC)無明顯變化。細胞增殖實驗提示，轉染microRNA21模擬物后，K562細胞對多柔比星敏感性減低，細胞凋亡減少;而轉染了microRNA21抑制劑后，K562/A02細胞對多柔比星敏感性明顯增高，細胞凋亡增多(圖4C、4D)。

圖4 microRNA21對K562/A02細胞多柔比星敏感性的影響Fig 4 Effect of microRNA21 on doxorubicin sensitivity

2.5 microRNA21對 K562/A02細胞中 Bcl-2表達的影響

蛋白質印跡檢測結果顯示，轉染陰性對照(NC)對Bcl-2表達無明顯變化;而轉染microRNA21抑制劑組，Bcl-2表達顯著降低，轉染了microRNA21模擬物的K562細胞中Bcl-2蛋白水平明顯增高(圖5)。

圖5 microRNA21對K562/A02細胞中Bcl-2表達的影響Fig 5 Effect of microRNA21 on Bcl-2 expression

3 討論

化療是白血病治療所不可缺少的一項措施。然而，隨著多藥耐藥的日趨產生，白血病復發率明顯增高。白血病多藥耐藥產生機制十分復雜，其中抗凋亡機制尤為重要［6］。幾乎所有的化療藥物都是通過誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用［8］。多藥耐藥的產生可能是白血病細胞通過表達一種抗凋亡蛋白(如 Bcl-2)誘導凋亡的作用［9］。

Bcl-2是細胞凋亡機制中的一種關鍵調節蛋白，是抑制凋亡的關鍵分子，在許多腫瘤中過表達，造成腫瘤的多藥耐藥。Bcl-2除了受轉錄因子和蛋白酶的調節作用外，近來，有人發現在腫瘤細胞中，Bcl-2的表達水平還受microRNA的影響，其中microRNA21 備受關注［10］。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA。成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的［4］。據推測，人類基因組可能存有1 000多種miRNA基因，目前已知700多種，約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調控。近來，越來越多的研究發現，miRNA與眾多腫瘤的多藥耐藥密切相關。microRNA21是一種致癌基因，在多種腫瘤中過表達，如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌和膠質母細胞瘤等［11］。microRNA21能下調視網膜母細胞瘤Ⅰ(RBI)，轉移生長因子β受體Ⅱ(TGFBR2)、程序性死亡基因4(PDCD4)等抑癌基因的表達，從而促進癌細胞增殖［12］。Bai等［13］的研究發現microRNA21在白血病耐藥中起關鍵作用。Meng等［14］證實，膽管癌患者存在 microRNA21過表達現象，并且這種過表達導致患者對吉西他濱不敏感。Si等［15］發現，用反義核酸技術下調microRNA21可以增強 MCF-7細胞對拓撲替康的敏感性，這可能是由于抑制microRNA21造成Bcl-2蛋白的低表達，從而促進了細胞凋亡。Dong等［16］發現microRNA21直接作用于Bcl-2，并上調其表達。然而，關于microRNA21與白血病多藥耐藥的報道較少。本研究發現，多柔比星耐藥的K562/A02細胞中microRNA21高表達，提示miRNA與白血病多藥耐藥有關，microRNA21可作為逆轉或預防白血病多藥耐藥的治療靶點。

雷公藤甲素又名雷公藤內酯醇，是臨床上應用的各種雷公藤制劑的主要活性成分。近來，大量研究發現TPL是一種廣譜的腫瘤抑制劑［17］。最近，陸續有研究報道TPL可以增強化療藥物的細胞毒作用。Chen等［18］發現，雷公藤甲素能夠提高5-氟尿嘧啶對KB細胞的抗腫瘤活性。

本實驗首先檢測了TPL對K562/A02及K562細胞的毒性。采用非細胞毒性濃度的TPL(5 nmol/L)作用于K562/A02細胞72 h后，可以顯著增強其對多柔比星的化療敏感性，K562/A02細胞中microRNA21表達水平明顯下降。進一步研究顯示，伴隨著microRNA21水平的下降，Bcl-2蛋白表達水平也降低。

綜上所述，本研究發現TPL可以提高慢性髓系白血病耐藥細胞K562/A02對多柔比星化療敏感性，其機制可能是通過下調microRNA21及其靶基因Bcl-2來促進多柔比星誘導的細胞凋亡所實現的，這為臨床白血病多藥耐藥的逆轉治療提供了新的思路。

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