外源性一氧化碳釋放分子對(duì)膿毒癥小鼠神經(jīng)系統(tǒng)抗炎的調(diào)節(jié)作用

仇雪楓，孫炳偉，王敏，孫艷，楊國(guó)濤，王波

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形科，江蘇鎮(zhèn)江212001)

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克及感染后常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，即便在基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究及重癥監(jiān)護(hù)手段高度發(fā)展的現(xiàn)代，臨床治療仍然收效甚微，死亡率居高不下。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有很強(qiáng)大的調(diào)控作用，其中以迷走神經(jīng)及其分泌的遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)所構(gòu)成的膽堿能抗炎通路的研究較為深入［1］。

近年研究結(jié)果證實(shí)，一氧化碳(CO)是機(jī)體內(nèi)一種重要的化學(xué)氣體信使，參與了炎性反應(yīng)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)［2］、缺血再灌注損傷［3］、內(nèi)毒素休克［4］等病理過(guò)程，發(fā)揮著重要的抗炎、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)作用。外源性一氧化碳釋放分子(carbon monoxidereleasing molecule-2，CORM-2)是近年來(lái)新合成的一種一氧化碳復(fù)合物，經(jīng)適當(dāng)溶劑溶解在生理環(huán)境中可以持續(xù)釋放CO。本研究組既往的研究證實(shí)，外源性一氧化碳能顯著改善膿毒癥時(shí)肝、肺、腎等重要臟器的功能，抑制炎癥反應(yīng)［5－11］。但是否能夠抑制膿毒癥時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)未見報(bào)道。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)建立小鼠膿毒癥模型，以CORM-2干預(yù)，并用卡巴膽堿做陽(yáng)性對(duì)照，觀察其對(duì)膿毒癥小鼠膽堿能遞質(zhì)的影響作用，旨在研究其對(duì)膿毒癥時(shí)膽堿能抗炎通路是否有輔助作用，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CORM-2、卡巴膽堿、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的α-銀環(huán)蛇毒素(FITC-α-BGT)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒購(gòu)自美國(guó) Biosource公司，550酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，TDL-40B臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠，高速低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 動(dòng)物分組及標(biāo)本收集

6～8周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雄性，48只，隨機(jī)分成4組(每組12只):假手術(shù)組、CLP模型組、CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組。CORM-2劑量:8 mg/kg尾靜脈注射。常規(guī)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。CLP模型制備:用2%異氟烷麻醉，面罩給氧。腹壁中線行1.0 cm切口，尋及盲腸，距盲腸壁1.0 cm處用3－0絲線結(jié)扎，20號(hào)針于盲腸壁穿孔，輕輕擠壓，見少量腸內(nèi)容物溢出。將盲腸置入腹腔，關(guān)閉切口。假手術(shù)組:將小鼠麻醉后，腹中線依層切開，將盲腸由腹腔取出再放回，關(guān)閉切口。切口處涂以碘伏。腹腔注射1 ml生理鹽水，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。術(shù)后24 h于麻醉狀態(tài)下進(jìn)行心臟采血，1 500 r/min離心，收集血清及腦組織標(biāo)本，－70℃保存。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小鼠腦組織的組織學(xué)觀察 腦組織塊浸泡固定于10%甲醛溶液。常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，光鏡觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 腦組織濕/干比測(cè)定 剝離小鼠大腦，迅速用吸水紙吸干表面水分和血液，電子天平稱濕重。然后置70℃烘箱內(nèi)烘烤，并定時(shí)稱重至恒重，記錄干重。計(jì)算公式:組織含水量=［(濕重－干重)÷濕重］×100%。

1.3.3 腦組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平檢測(cè) 分別用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.4 腦組織乙酰膽堿濃度檢測(cè) 將10 μl的膽堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到990 μl的膽堿緩沖液中配制成0.5 nmol/μl的膽堿標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。樣品的乙酰膽堿濃度=Cho/Sv，Cho為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的樣品讀數(shù)(nmol)，Sv是加入到樣品孔中樣品的體積(μl)。

1.3.5 乙酰膽堿酯酶活性的檢測(cè) 小鼠心臟采血后，放入盛有3 ml pH7.4的磷酸鹽緩沖液的小試管中，混勻后取出1.5 ml置于另一小試管中，作為測(cè)定管;原管作為對(duì)照管。向?qū)φ展苤屑尤?滴毒扁豆堿溶液，混勻。兩管同置37℃水浴中預(yù)熱5 min。向兩管中分別加入已在37℃保溫的5，5'二硫代雙(2-硝基苯甲酸)和碘化硫代乙酰膽堿(ASCh)應(yīng)用液各0.5 ml。加入ASCh溶液時(shí)，立即混勻并計(jì)時(shí)，在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)6 min后，向測(cè)定管中加入l滴毒扁豆堿溶液終止反應(yīng)，離心除去血細(xì)胞。取上清液放入比色杯中，于412 nm波長(zhǎng)處，以水為參比，讀取光密度(D)，對(duì)照管的光密度為D'，求D－D'值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得全血膽堿酯酶活性單位。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織病理學(xué)改變的影響

假手術(shù)組小鼠大腦結(jié)構(gòu)完整清晰，腦組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，腦回清晰;CLP模型組可見腦組織明顯腫脹，腦回結(jié)構(gòu)紊亂，中性粒細(xì)胞聚集和浸潤(rùn);CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組:腦組織仍然有水腫，血管擴(kuò)張充血，但腦細(xì)胞變性和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(圖1)。

圖1 CORM-2干預(yù)對(duì)膿毒癥小鼠腦組織病理變化的影響(HE×100)Fig 1 Effects of CORM-2 on pathological change in the brain of sepsis mice(HE×100)

2.2 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織濕/干比的影響

與假手術(shù)組比較，CLP模型組小鼠腦組織的濕/干比明顯增大(P＜0.05)，顯示腦水腫明顯;與CLP模型組比較，CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組腦組織濕/干比變化不大(P＞0.05)，表明腦組織水腫程度沒(méi)有得到明顯改善(圖2)。

圖2 CLP小鼠腦組織濕/干重比Fig 2 Brain W/D ratio in the CLP-challenged mice

2.3 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平的影響

與假手術(shù)組比較，CLP模型組小鼠腦組織TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01);與CLP模型組比較，CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組TNF-α、IL-6的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，見表1。

表1 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平的影響Tab 1 Effects of CORM-2 on TNF-α and IL-6 production in the brain of CLP-challenged mice n=12

2.4 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織乙酰膽堿濃度和血清乙酰膽堿酯酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，CLP模型組小鼠的腦組織乙酰膽堿濃度變化不大，CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組乙酰膽堿濃度明顯高于CLP模型組(P＜0.05);血清乙酰膽堿酯酶活性CLP模型組較假手術(shù)組組明顯增加(P＜0.01)，CORM-2干預(yù)組和卡巴膽堿組較CLP組明顯下調(diào)(P＜0.05)，見表2。

表2 CORM-2對(duì)CLP小鼠腦組織乙酰膽堿濃度和血清乙酰膽堿酯酶活性的影響Tab 2 Effects of CORM-2 on acetylcholine concentration in the brain and on serum AChE levels in CLP-challenged mice n=12

3 討論

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克及感染后常見的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征。分析表明，全世界10%的死亡患者與膿毒癥密切相關(guān)。由于膿毒癥的病理過(guò)程極其復(fù)雜，只有致力于闡明其確切的病理生理機(jī)制，尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)，才有希望逐步解決目前臨床膿毒癥防治的重重困難。

在神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，迷走神經(jīng)及神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿所構(gòu)成的膽堿能抗炎通路的抗炎作用逐漸被揭示。膽堿能抗炎通路的研究表明［1］，刺激迷走神經(jīng)或者直接給予擬膽堿藥物(如煙堿)能明顯抑制體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。Borovikova等［12］經(jīng)過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，刺激外周迷走神經(jīng)或直接給予N樣膽堿能受體激動(dòng)劑煙堿，能顯著抑制內(nèi)毒素刺激人血巨噬細(xì)胞的TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的釋放作用，而給予M樣膽堿能受體激動(dòng)劑毒蕈堿時(shí)此抑制作用明顯低于煙堿。卡巴膽堿是一種人工合成的擬膽堿藥物，并同時(shí)具有抗膽堿酯酶的間接作用，但其分子結(jié)構(gòu)與煙堿明顯不同。它同時(shí)作用于M樣和N樣膽堿能受體，不僅能擴(kuò)張血管、促進(jìn)胃腸動(dòng)力、增加腺體分泌，還能減輕局部和全身炎癥反應(yīng)。以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，卡巴膽堿能降低內(nèi)毒素休克動(dòng)物血和組織TNF-α水平，改善臟器功能。卡巴膽堿腸內(nèi)注射能顯著減輕腸缺血再灌注損傷后腸黏膜的炎癥反應(yīng)和病理?yè)p傷［13］。研究還發(fā)現(xiàn)卡巴膽堿在膽堿能抗炎通路中通過(guò)結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的nAChR α7受體發(fā)揮抗炎作用，該作用能被金銀環(huán)蛇毒競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合nAChR α7而拮抗，從而抑制乙酰膽堿及煙堿在膽堿能抗炎通路中的作用。

CO作為炎性反應(yīng)一系列病理生理反應(yīng)中的一種新的內(nèi)源性介質(zhì)和干預(yù)因子開始受到重視。既往常采用吸入CO作為外源性CO的來(lái)源，它的弊端較多:裝置復(fù)雜、吸入濃度較難控制和維持、難以在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)追加劑量、易導(dǎo)致碳氧血紅蛋白血癥等［14］。近年合成的 CORM，可以通過(guò)溶解后釋放CO發(fā)揮生理作用，在一定生理劑量時(shí)并不提高動(dòng)物體內(nèi)碳氧血紅蛋白的濃度。我們既往的研究證實(shí)，CORM作為外源性CO的供體，對(duì)嚴(yán)重?zé)齻笤缙谥匾K器(肝、肺、腎、小腸等)的炎性反應(yīng)具有明顯的抑制作用。但是否能夠抑制膿毒癥時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)未見報(bào)道。

本研究通過(guò)建立小鼠膿毒癥模型，使用外源性一氧化碳干預(yù)，同時(shí)使用卡巴膽堿干預(yù)作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察其對(duì)神經(jīng)抗炎膽堿能通路的干預(yù)作用。研究結(jié)果顯示，給予外源性一氧化碳干預(yù)后膿毒癥小鼠體內(nèi)膽堿酯酶的活性被下調(diào)，從而減少對(duì)抗炎神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的降解，使得乙酰膽堿能夠在體內(nèi)存留更長(zhǎng)時(shí)間，促進(jìn)其與巨噬細(xì)胞表面膽堿能受體的結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制促炎因子的生成和釋放。本組結(jié)果還表明，CORM干預(yù)后TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的釋放均被下調(diào)，證實(shí)局部或全身的炎癥反應(yīng)在一定程度上被抑制。

目前CO的抗炎癥反應(yīng)、抗氧化作用已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CO作用于膽堿能抗炎通路并促進(jìn)其抗炎作用的詳細(xì)機(jī)制和量效關(guān)系尚需進(jìn)一步深入的研究，從而為臨床治療嚴(yán)重炎癥反應(yīng)和膿毒癥提供新思路。

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