燕麥種子萌發過程中提取物的抑菌作用研究

胡青平 徐建國

燕麥種子萌發過程中提取物的抑菌作用研究

胡青平1徐建國2

(山西師范大學生命科學學院1，臨汾 041004)
(山西師范大學食品科學與工程系2，臨汾 041004)

以4種食品腐敗菌為指示菌，采用濾紙片法和液體倍比稀釋法對裸燕麥(Avena nuda L．)種子萌發過程中不同溶劑提取物的抑菌作用和最低抑菌濃度(MIC)進行了比較研究。試驗結果表明，乙酸乙酯提取物的抑菌作用較好，但在種子萌發過程中抑菌效果不同，萌發24 h時燕麥種子的乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強，其中對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(22．31±0．05)mm;其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC小于6．25%，對鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的最低抑菌濃度MIC小于12．5%，旨為燕麥的綜合利用及新型天然防腐劑的研發提供理論依據。

燕麥種子 萌發 抑菌

燕麥(Avena L．)為禾本科一年生草本植物，是重要的糧食與飼料兼用作物，也是食品加工的重要原料。燕麥有皮燕麥(A．vena L．)和裸燕麥(A．nuda L．)之分，我國的燕麥以裸燕麥為主［1］。裸燕麥的營養價值在禾谷類作物中居首位，蛋白質含量高達14%～19%［2］，氨基酸的含量多、種類齊全。燕麥中還含有亞油酸和皂甙素，能降低血清總膽固醇、甘油三脂和β2脂蛋白T，防治動脈粥樣硬化，對預防和治療高血壓、冠心病和糖尿病均屬有益［3］，因此開發和利用燕麥產品具有重要的實踐意義。

化學合成防腐劑的安全性問題，使人們越來越注重植物源天然食品防腐劑的研發［4－5］。目前國內外關于燕麥的研究主要集中在β－葡聚糖［6］、蛋白質［7］、油脂［8］等方面的提取鑒定及其抗氧化活性［9］，而燕麥對微生物生長抑制作用的研究不多，主要有以下報道:皮燕麥的根皂甙提取物［10－11］、幼苗的黃酮類和皂苷類提取物［12］、種子的水提取物［13］、皮燕麥中的甾醇提取物［14］和裸燕麥麩皮中的β－谷甾醇提取物［15］均有不同程度的抑菌作用。但對其抑菌作用的研究存在一些局限性:(1)燕麥品種以皮燕麥為主;(2)對抑制食品腐敗菌的研究較少;(3)對燕麥萌發過程中抑菌作用的動態變化未見詳細報道;這些不足限制了燕麥天然防腐劑的開發和應用推廣。因此，本研究以裸燕麥為研究對象，采用濾紙片法和液體倍比稀釋法對其種子萌發過程中不同溶劑初提物的抑菌作用和最低抑菌濃度MIC進行了比較研究，旨為我國特色燕麥資源——裸燕麥的綜合利用及新型天然防腐劑的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 供試材料

燕麥:壩筱1號。

1．2 供試菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis):山西師范大學生命科學學院微生物實驗室。

1．3 儀器與設備

HY－4型調速多用振蕩器:江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;RE－52旋轉蒸發儀:上海亞榮生化儀器廠;YWQ－LS－STT型自動立式壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SPX－300BG型生化培養箱:國華電器;722分光光光度計:上海精密科學儀器有限公司。

1．4 方法

1．4．1 燕麥種子提取物的制備

準確稱取粉碎的燕麥樣品20．0 g，平均分成4份，放入250 mL的三角瓶中，分別加入50 mL的蒸餾水、甲醇、丙酮和乙酸乙酯。30℃下超聲30 min后，于8 000 r/min離心15 min，濾渣重復提取1次。合并上清液旋轉蒸發，定容10 mL，4℃保存4種提取液備用。

1．4．2 燕麥種子萌發過程中提取物的制備

燕麥種子萌發樣品分別是:原種子、浸泡12 h、發芽12 h、發芽24 h、發芽36 h、發芽48 h、發芽60 h，共7個處理。準確稱取粉碎的7個萌發過程中的燕麥樣品各5．0 g，按照1．4．1中所描述的方法，用乙酸乙酯提取各樣品，4℃保存備用。

1．4．3 指示菌液的制備

將保存的各種指示菌種接種于LB斜面培養基中，在37℃恒溫培養箱內培養24 h，活化2次。用接種環挑取少量活化管中的指示菌于裝有玻璃珠及50 mL LB液體培養基的三角瓶內，振蕩培養14 h，采用麥氏濁度法［16］測量菌濃，即用生理鹽水配置成梯度菌液，以麥氏0．5標準管為對照，用分光光度計測量560 nm下的OD值，選擇與0．5號麥氏濁度相同的菌懸液，指示菌濃度約為108cfu/mL。

1．4．4 燕麥種子提取液的抑菌試驗

采用濾紙片法［16］測定燕麥種子萌發過程中提取物的抑菌作用。先用無菌棉簽沾取菌液，涂布于LB培養基上，而后用無菌鑷子夾取直徑8 mm無菌濾紙片，將濾紙片貼在含菌平板上，輕壓濾紙片使其與培養基接觸良好，每皿貼4片，呈十字形對稱放置，在每個濾紙片上，滴加30μL經微孔過濾器過濾的四種提取液，對稱的兩個濾紙片為對照組。等待檢液完全滲入后，將平板放入37℃恒溫培養箱中培養20 h，定時觀察，并測定抑菌圈的大小，比較抑菌效果。

1．4．5 乙酸乙酯提取液MIC的確定

采用液體倍比稀釋法［17］，選取發芽24 h燕麥種子的乙酸乙酯提取物(按100%計)，稀釋成50%、25%、12．5%、6．25%、3．12%5個梯度濃度的稀釋液，在無菌條件下，分別取100μL稀釋液與1μL 0．5麥氏濁度的各菌液混勻，均勻涂布于平板上，每種指示菌的每個提取稀釋液重復3次。同時取1．1 mL 0．5麥氏濁度的菌懸液涂布，作為陰性對照;另取一不加任何物質的平板，作為陽性對照。37℃恒溫箱中培養20 h，以不長菌的提取物的最小濃度為該提取物的MIC。

1．5 數據處理

試驗重復3次，數據經Excel進行ANOVA分析(P＜0．05)。

2 結果與分析

2．1 不同溶劑提取物抑菌效果的比較

用濾紙片法分別對水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的燕麥提取物進行了抑菌試驗，結果見表1和圖1。

表1 不同溶劑燕麥種子提取物的抑菌效果/mm

圖1 不同溶劑燕麥種子提取物的抑菌結果

由表1和圖1可以看出，燕麥種子的水提取物對4種指示菌都沒有抑制作用，甲醇、丙酮、乙酸乙酯的燕麥種子提取物對4種指示菌都有不同程度的抑制作用，其中，乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最為顯著，其相對抑菌圈大小分別為(12．75±0．05)mm和(12．54±0．03)mm。所以，選取乙酸乙酯提取物備用。

2．2 燕麥種子萌發過程中乙酸乙酯提取物的抑菌作用

用濾紙片法，對燕麥種子萌發過程中的7個處理乙酸乙酯提取物的抑菌進行了比較，即未處理、浸泡12 h、發芽12 h～60 h(每12 h取1次樣)，結果見表2和圖2。

由表2和圖2結果顯示，燕麥種子在萌發過程中抑菌效果不同，隨種子發芽時間的增長抑菌效果越明顯，但達到一定時間后又下降。其中，燕麥種子發芽24 h時的乙酸乙酯提取物的抑菌效果最好(P＜0．05)，尤其是對大腸桿菌的抑菌作用明顯強于其他3種菌(P＜0．05)，其抑菌大小順序為大腸桿菌＞鼠傷寒沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞腸炎沙門氏菌，其中對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(22．31±0．25)mm。這可能是由于在燕麥種子萌發過程中，抑菌物質的種類和含量發生變化導致的。

表2 燕麥種子萌發過程中乙酸乙酯提取物的抑菌效果/mm

圖2 燕麥種子萌發過程中乙酸乙酯提取物的抑菌效果

2．3 乙酸乙酯提取物MIC的測定

經發芽24 h的燕麥種子，用乙酸乙酯提取的抑菌物質，對4種指示菌的MIC結果見表3。

表3 乙酸乙酯提取物對4種指示菌的MIC/%

MIC是衡量抗菌活性大小的一個指標，由表3結果顯示，當指示菌為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌時，乙酸乙酯提取物的MIC小于6．25%;當鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為指示菌時，乙酸乙酯提取物的MIC小于12．5%，說明燕麥種子萌發24h的乙酸乙酯提取物對前2種指示菌的抑菌作用強于后2種指示菌。

3 討論與結論

不做任何處理的燕麥種子的4種提取物中，乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強，對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑達(13．51±0．03)mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(12．54±0．03)mm;燕麥種子不同萌發時間的乙酸乙酯提取物，具有不同的抑菌效果，其中萌發24 h的燕麥種子乙酸乙酯提取物的抑菌作用最強，對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(22．31±0．05)mm;萌發24 h的燕麥種子乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC小于6．25%，而對鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的最低抑菌濃度MIC小于12．5%。可見，發芽可作為提高燕麥利用價值的有效手段。燕麥富含多酚、黃酮、甾醇等多種不同極性的活性物質，且這些物質在萌發過程中會有不同的變化［18］。因此，燕麥萌發過程中不同溶劑提取物的組成成分、結構及其抑菌機理有待于進一步研究。

［1］路長喜，王岸娜，周素梅．等．燕麥片加工品質評價及其品種相關性研究［J］．中國糧油學報，2009，24(8):42－47

［2］趙世鋒，田長葉，王志剛，等．我國燕麥生產和科研現狀及未來發展方向［J］．雜糧作物，2007，27(6):428－431

［3］任嘉嘉，魏益民，張波，等．高溫處理燕麥籽粒對制粉及其營養成分的影響［J］．中國糧油學報，2008，23(6):98－102

［4］白秀君，蔣益虹，楊海燕．荷葉提取液的抑菌特性研究［J］．中國食品學報，2007，7(3):90－93

［5］蔣立文，彭巧云，易燦，等．納豆提取物抑菌效果的初探［J］．中國食品學報，2008，8(6):86－90

［6］申瑞玲，王志瑞，李宏全．等．燕麥β－葡聚糖對高膽固醇血癥大鼠血脂和生長的影響［J］．中國糧油學報，2009，24(1):44－48

［7］魏決，羅雯．燕麥中蛋白質的提取、純化及氨基酸成分分析［J］．成都大學學報(自然科學版)，2007，26(4):283－285

［8］魏決，郭玉蓉，金小培，等．燕麥油脂的理化性質研究及脂肪酸組成分析［J］．食品科技，2006，7:204－206

［9］田斌強，鄧乾春，郭珊珊．等．化學發光法對燕麥貯藏蛋白質抗氧化活性的評價［J］．中國糧油學報，2010，25(1):28－32

［10］Maizel J V，Burkhardt H J，Mitchell H K Avenacin，an antimicrobial substance isolated from Avena sativa．I．Isolation and antimicrobial activity［J］．Biochemistry，1964，3(3):424－426

［11］Burkhardt H J，Maizel JV，Mitchell H K．Avenacin，an antimicrobial substance isolated from Avena sativa．Ⅱ．Structure［J］．Biochemistry，1964，3(3):426－431

［12］Bahraminejad S，Asenstorfer R E，Riley I T，et al．Analysis of the antimicrobial activity of flavonoids and saponins isolated from the shoots of oats(Avena sativa L．)［J］．Journal of Phytopathology，2008，156:1－7

［13］S?rensen H P，Madsen L S，Petersen J，etal．Oat(Avena sativa)seed extract as an antifungal food preservative through the catalytic activity of a highly abundant class I chitinase［J］．Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160:1573－1584

［14］洪慶慈，王梅，姜偉，等．燕麥中主要甾醇的鑒定和效能試驗［J］．食品科學，2002，23(1):103－106

［15］烏漢其木格．裸燕麥麩皮中β－谷甾醇的分離提取及其特性研究［D］．呼和浩特:內蒙古農業大學，2007

［16］李昌靈，沈廷．刺天茄提取物的抑菌作用研究［J］．安徽農業科學，2009，30(2):652－667

［17］孫石磊，姚衛蓉．楊梅果實不同溶劑提取物抑菌特性的研究［J］．中國微生態學雜志，2009，21(3):229

［18］Jian－guo Xu，Cheng－rui Tian，Qing－ping Hu，et al．Dynamic changes in phenolic compounds and antioxidant activity in oats(Avena nuda L．)During steeping and germination［J］．Journal Agricultural and Food Chemistry．2009，57:10392－10398．

Study on the Antimicrobial Effect of Oat Seeds Extracts during the Germination

Hu Qingping1Xu Jianguo2
(College of Life Science，Shanxi Normal University1，Linfen 041004)
(Department of Food Science and Engineering，Shanxi Normal University2，Linfen 041004)

Taking oat(Avena nuda L．)seeds as subject，Paper－disc and double dilution as methods，antibacterial activity of different solvents(water，methanol，acetone and ethyl acetate)from oat and the Minimal Inhibitory Concentration(MIC)of ethyl acetate extract on four food corruption bacteria were investigated．The results showed that the inhibition of ethyl acetate extract on bacteria was better than other solvents extracts．But the antibacterial activity was changing in the germination of oat seeds．If oat seed was germinated for 24 h，the ethyl acetate extracts had the strongest antibacterial activity on four bacteria，about(22．31±0．05)mm of inhibition diameter against Escherichia coli．The Minimal Inhibitory Concentration(MIC)on Staphylococcus aureus and E．coli were less than 6．25%．However，MIC on Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis were less than 12．5%．This paper provides theoretical references for the comprehensive utilization of oat and development of new type of natural antiseptic．

oat seed，germination，antibacterial activity

TS201．3

A

1003－0174(2012)06－0027－04

時間:2012－05－31 16:46

網絡出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120531．1646．004．html

國家自然科學基金項目(31071722)，中國博士后基金(2011M501444)，山西省優秀人才支撐項目(晉教科［2011］4號)，山西省軟科學(2010041031－02)

2011－10－12

胡青平，女，1972年出生，副教授，博士，應用微生物

徐建國，男，1971年出生，副教授，博士，植物資源開發利用