缺失線粒體DNA的人喉癌細胞系的建立

王 磊，程鶴香，趙 倩，陳 鷗，趙 明＊

（1.吉林大學第二醫院 耳鼻咽喉科，吉林 長春130041；2.佳木斯市中心醫院 耳鼻咽喉科）

喉癌是東北的高發癌癥之一，其主要的治療方法主要是手術、放化療等。其病因主要與吸煙相關，可能的機制是吸煙產生的毒性致癌物質導致的線粒體DNA損傷所致。近年研究發現在許多人類腫瘤中有大量的線粒體基因組缺陷，線粒體基因組改變的頻率非常高，包括膀胱、頭頸、肺和乳腺、前列腺腫瘤等。體細胞線粒體DNA突變被認為是腫瘤早期發生的標志。線粒體DNA突變是否參與腫瘤形成及尋找線粒體中的體細胞突變是目前腫瘤研究的熱點［1－3，14］。

研究喉癌的線粒體功能和突變，需要有喉癌細胞的線粒體缺失細胞，由于線粒體缺失細胞系的構建非常困難，所以一直以來人們利用1989年由Attardi構建的無線粒體的骨肉瘤細胞系進行線粒體功能研究，但是不同種類的細胞結構，生長，分化突變特點等均有特異性，如果進行喉癌線粒體功能的研究，能有線粒體DNA缺失的人喉癌細胞系，是非常重要的［4－7］。我們構建線粒體缺失的喉癌細胞，為后續構建融合喉癌細胞、線粒體突變和線粒體功能研究提供細胞模型，同時也為研究線粒體DNA突變和喉癌發生之間的關系奠定了基礎。

本實驗采用人穩定傳代喉癌細胞系JHUo11作為母本細胞，通過低劑量溴化乙錠持續作用于該細胞，誘導線粒體缺失DNA，成功制備出ρ0（無線粒體）細胞。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國 Hyclone公司；溴化 乙錠 （ethidium bromide，EtBr，EB）、丙酮酸（pyruvate）、尿苷（urideine）購自美國Sigma公司；動物細胞基因組DNA快速提取試劑盒購自北京莊盟生物基因科技有限公司；PTC200 PCR儀 ；TECNAI10透射電子顯微鏡；恒溫二氧化碳培養箱。

1.2 ρ0細胞的構建

人喉癌細胞o11在加10%FBS的RPMI1640培養基中培養，生長良好后開始進行ρ0細胞的構建。將生長良好的喉癌細胞o11分裝在4個培養盤中，并標號。細胞放入37℃、5%CO2培養箱中繼續長期培養，期間約2d換液1次，3～4d或細胞生長融合達80%時傳代1次。每次換液或傳代時各個序號的培養盤加入丙酮酸、尿苷。加或不加溴化乙錠。見表1。

表1 四組o11細胞加入藥品列表

1.3 無mtDNA的細胞系鑒定

1.3.1 光鏡下觀察無線粒體細胞系及生長缺陷的鑒定 將經EB處理90天后的人喉癌細胞o11換用含10%胎牛血清及RPMI1640培養基中培養（不含丙酮酸鈉和尿嘧啶），每2－4天換液1次，與同批非選擇培養的人喉癌細胞作對照，觀察細胞生長、形態及死亡情況。

1.3.2 PCR檢測 將各組細胞經胰酶消化，離心收集細胞。參照試劑盒提供的操作說明進行。將全基因組DNA提取后進行PCR擴增。目的基因為線粒體DNA上任選一段序列，正向引物為（5’－GGTCTATCACCCTATTAACCAC－3’）（nt 8－29）；反向引物為（5’－CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA－3’）（nt 408–429），擴增產物為420bp。反應體系按操作說明書設定，按以下反應條件進行擴增：預變性94℃5min，然后變性94℃30s，復性55℃30s，延伸72℃1.5min共30個循環，最后72℃延伸10min。產物在10%瓊脂糖凝膠電泳分析。在1號細胞中有線粒體編碼的基因雜交條帶顯示，而在線粒體DNA完全缺失的細胞株中（3號）無相應雜交條帶顯示。電泳液為TBE緩沖液，電泳1.5h，紫外燈下觀察并拍照。

1.3.3 健那綠染色活細胞 健那綠（Janu’s Green B）（sigma公司）是脂溶性的堿性染料，是對線粒體專一的活細胞染料，可使線粒體呈現藍綠色，而細胞質接近無色，毒性很小，通常線粒體的鑒定用健那綠活染法。配制1%健那綠染液：將0.5g健那綠溶解于50mL生理鹽水中，加溫到30－40℃，使其充分溶解。將1號對照盤細胞和經過PCR鑒定的3號盤細胞分別放入35mm的培養盤中，當細胞生長融合達80%時加入1%健那綠2滴，等2－5分鐘后置于高倍光鏡下觀察。

2 結果

人喉癌細胞培養良好后開始進行mtNDA耗損實驗，1號培養盤為不加EB的對照細胞，平均每兩日需傳代一次。細胞生長速度最快。2號培養盤中的細胞在含有50ng／ml EB培養液中生長較為迅速，平均每3天即可傳代，2號培養盤中的細胞增殖較3號培養盤中的細胞快，3號培養盤細胞加入75 ng／ml溴化乙錠，細胞增殖較慢，需每4天換液。持續作用90天后成功構建。4號培養盤中加入EB100ng／ml，細胞生長速度最慢，需一周傳代一次，培養至2周時細胞80%以上懸浮死亡。每組細胞、、細胞在加EB初期死亡細胞明顯增多，生長速度減慢，隨著培養時間的增長，細胞對EB的毒性效應逐漸耐受，死亡細胞逐漸減少。細胞在溴化乙錠的慢性毒性作用過程中，光鏡觀察細胞結構，發現細胞形態變大，變圓，透光度增加，見圖1，2。

將1號、2號、3號盤中的細胞全基因組DNA提取后進行PCR擴增。目的基因為線粒體上的基因片段約420bp，PCR結果顯示，對照組1號培養盤擴增出目的片段位于500bp附近，3號盤未擴增出，2號盤擴增出500bp的片段，顏色比1號盤明顯變淺，因此可證實3號培養盤細胞中mtDNA已被完全去除，見圖3，左起第一為DNA marker，依次是3號盤細胞，1號盤，2號盤。2號盤的細胞經EB處理后，其中的線粒體DNA已大部分消失，但由于EB濃度較低還不足以將線粒體DNA完全去除，故表現為弱淺條帶。而4號盤由于EB濃度過高，喉癌細胞系o11不能耐受EB的毒性，故2周內逐漸死亡。

圖1 光鏡下未加EB的o11細胞

圖2 光鏡下加EB 90天的o11細胞

圖3 處理90天后各組細胞線粒體DNA的PCR結果

將已經去除線粒體的3號盤細胞1：2傳代分裝在3a盤和3b盤中。兩盤細胞均不加EB，3a盤中細胞在加丙酮酸及尿苷培養液中培養，濃度及量同前。3b盤中細胞在不加丙酮酸及尿苷培養液中培養，發現3a盤中的細胞在有丙酮酸及尿苷的培養基中正常生長。而3b盤中細胞在無丙酮酸及尿苷的培養基中第1天開始細胞逐漸懸浮、腫脹至第三天死亡。這種嘧啶和丙酮酸依賴性說明，線粒體DNA已耗盡。

健那綠是脂溶性的堿性染料，易于被細胞吸收，是對線粒體專一的活細胞染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態（即有色狀態）呈藍綠色而使線粒體顯色，而在周圍的細胞質中染料被還原，成為無色狀態。1號盤細胞是未經處理的對照細胞，線粒體正常存在，健那綠染色后可見藍綠色散在線粒體分布，而3號盤中未見藍綠色染色體。見圖4和圖5。由于健那綠對線粒體有專一性，進一步證實3號盤細胞為無線粒體的ρ0細胞。

3 討論

目前對于無線粒體細胞的誘導培養方法較多，較經典的是溴化乙錠誘導法，其他的有抑制呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ的魚藤酮及抗癌藥物地特氯銨誘導法、抗愛滋病藥物雙脫氧胞苷誘導法、質粒轉染誘導法［4，6，10］。

圖4 未加EB處理的o11細胞（健那綠染色）

圖5 加EB 90天后的o11細胞（健那綠染色）

無線粒體細胞（ρ0）是通過長期暴露于低濃度的溴化乙錠而建立的，溴化乙啶可以與mtDNA的雙鏈較牢固結合，抑制細胞分裂時的mtDNA的復制和轉錄，使細胞分裂后mtDNA數量每次減少1／2，逐次減少，數量表示為原來數量的1／2n。由于細胞線粒體內有限的mtDNA拷貝，當分裂次數n足夠大時，數量的1／2n將接近零，即細胞線粒體內沒有有效的 mtDNA［5，9］。

溴化乙錠耗損mtDNA的劑量和作用時間在不同的細胞差別較大，劑量從25ng／ml到5μg／ml不等，處理時間由20多天到210多天。細胞ρ0是一類完全缺少mtDNA的細胞。自從King和Attardi利用骨肉瘤細胞構建出第一個人類ρ0細胞后，目前已有多種類型的細胞ρ0產生，如 HeLa細胞、SKHep1細胞、肺癌細胞系等ρ0細胞，但仍有許多細胞株不能被誘導成功［4，14］。判斷一種細胞是否能培養成ρ0細胞，將細胞用EB處理一定時間后，將均加入相等的丙酮酸鈉及尿嘧啶。２、３、４號盤中的養，若細胞在無尿嘧啶的培養基中逐漸懸浮、腫脹，死亡，而在有尿嘧啶的培養基中正常生長，則該細胞具有較強的培養成ρ0細胞的潛力；如果兩種培養基中細胞均正常生長，則該細胞可能對藥物有耐性，不能失去mtDNA，很難培養成細ρ0胞；如果兩種培養基中細胞均死亡，也不可能培養成ρ0細胞［11－13］。

線粒體DNA缺失細胞系，其原理可抑制整個胞漿中的線粒體DNA的復制，但不影響核DNA復制。無二氫乳氫酸脫氫酶活性，具有尿嘧啶和丙酮酸依賴性，利用丙酮酸通過糖酵解途徑獲得能量，需補充外源性丙酮酸和尿苷來維持其生存［5，11，12］，還能夠接受外源性線粒體DNA發揮作用［10］。本實驗選用75μg／ml的濃度來耗損mtDNA，間隔一段時間采用光鏡和PCR擴增檢測人喉癌細胞mtDNA耗損的情況，結果發現細胞在耗損開始階段死亡的較多，但隨著培養時間的延長死亡細胞逐漸減少，細胞逐漸適應了培養基的生長環境，經過大約90天就成功構建出ρ0細胞。

ρ0細胞的篩選非常困難，不易獲得成功，即使成功，至少要幾個月的時間，國內外尚未發現無線粒體喉癌細胞系構建的文章。線粒體DNA突變與頭頸腫瘤的發生關系密切，ρ0細胞因缺乏mtDNA可以用來構建出各種胞質雜交融合細胞（cybrid），建立喉癌線粒體基因改變模型，我們可以利用該細胞研究相同的核遺傳背景下不同線粒體DNA分子的基因改變及功能變化，為喉癌的發生機制和線粒體DNA突變的相關性的研究奠定基礎。

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