臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性

賈芙蓉，何 欣，丁 旭，王 輝，張明明，楊旭紅

（1.解放軍第二〇八醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130062；2.吉林省出入境檢驗(yàn)檢疫局）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，為多能干細(xì)胞的一種。它最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，具有向三種胚層細(xì)胞分化的多向分化潛能［1］。近年來，隨著細(xì)胞生物技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞移植已經(jīng)在臨床開始應(yīng)用，間充質(zhì)干細(xì)胞成為人們研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)從臍帶分離培養(yǎng)出MSC，并對(duì)其形態(tài)、免疫表型等基本特性進(jìn)行研究，為干細(xì)胞來源和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α－MEM 培養(yǎng)基（Sigma，USA），PBS（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），T25培養(yǎng)瓶（NEST），0.1%膠原酶I（Sigma，USA），0.25%胰酶（Sigma，USA），地塞米松 0.1μmol／L、β－甘油磷酸鈉鹽10mmol／L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol／L T75培養(yǎng)瓶（NEST），150mm 培養(yǎng)皿（NEST），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），低溫離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州潔諾凈化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 UC－MSC的原代培養(yǎng) 健康足月胎兒臍帶經(jīng)產(chǎn)婦同意后，根據(jù)倫理委員會(huì)通過的指導(dǎo)原則采集，將臍帶用75%酒精沖洗，然后剔除動(dòng)脈和靜脈，剪碎，成糊狀。用0.1%膠原酶I、雙抗，37℃消化24小時(shí)，再加入0.25%胰酶和鹽水，37℃消化1小時(shí)，然后加入鹽水混勻，離心，沉淀用α－MEM培養(yǎng)液接種于T25培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為P0。把培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，4－6天后換液，棄去非貼壁細(xì)胞后，每3天換液一次。

1.2.2 UC－MSC的傳代和純化 原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖在瓶底融合基本達(dá)到90%時(shí)，用0.25%胰酶和鹽水按1∶1混合，消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，再用移液管輕輕吹打，使細(xì)胞脫壁，然后放入離心管中，1 300r／min，離心5min，棄去上清，收集細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液，混勻后傳代。傳于T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，標(biāo)記為P1。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換液一次，至貼壁細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，消化傳代，按1∶3傳代于150mm培養(yǎng)皿中。之后重復(fù)上面操作，反復(fù)傳代到P6代。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞，消化后，按1×104個(gè)細(xì)胞／孔接種于24孔板，每隔24小時(shí)消化3個(gè)孔，收集細(xì)胞。用胎盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1.0×104細(xì)胞／孔），非誘導(dǎo)組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)組培養(yǎng)液中加入標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑（地塞米松0.1μmol／L、β－甘油磷酸鈉鹽10mmol／L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol／L）進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，每3天全量換液，第14天應(yīng)用堿性磷酸酶組化染色試劑盒進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色、應(yīng)用4－NPP法檢測(cè)ALP活性，第21天Von kossa染色。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，將貼壁細(xì)胞常規(guī)消化，PE標(biāo)記CD44，CD73，CD31，CD45，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察，接種后的UC－MSC呈小圓顆粒，1－3天后開始貼壁，7－10天后，可見貼壁細(xì)胞呈紡錘形，多角形，梭形。2周后，增長(zhǎng)速度較快，2－3周后可形成片狀融合達(dá)到80%－90%，呈現(xiàn)平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，可以傳代。傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞生長(zhǎng)快，連續(xù)傳6代，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。見圖1。

圖1 UC－MSC細(xì)胞形態(tài)

2.2 生長(zhǎng)曲線

傳代后各代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈S型，第1－2天細(xì)胞處于潛伏期，無明顯增殖，一般第3天開始增長(zhǎng)，第10－12天可達(dá)到80%以上融合，然后進(jìn)入平臺(tái)期，見圖2。

圖2 UC－MSC生長(zhǎng)曲線

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC－MSC表面標(biāo)志

取第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD31陽性率0.1%，CD45陽性率0.2%，CD44陽性率93.5%，CD73陽性率40.0%。見圖3。

2.4 成骨與成脂定向誘導(dǎo)分化與鑒定

成骨分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后1周，部分細(xì)胞基質(zhì)出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣鈣沉積。培養(yǎng)2周之后，按堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行堿性磷酸酶染色。染色后，堿性磷酸酶在胞漿內(nèi)顯示為藍(lán)色顆粒狀物，對(duì)照組細(xì)胞未加誘導(dǎo)劑，堿性磷酸酶染色呈陰性。成脂分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后1周時(shí)，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)微小明亮的脂滴。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞增多，細(xì)胞由梭形變成橢圓形或角形。培養(yǎng)2周后，脂滴數(shù)目增多、融合。油紅0染色后鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂滴呈明亮橙紅色，非誘導(dǎo)組呈陰性。見圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)UC－MSC

圖4 成骨與成脂定向誘導(dǎo)分化和鑒定

在成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，進(jìn)行Von kossa染色，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組出現(xiàn)黑色的礦化結(jié)節(jié)，非誘導(dǎo)組細(xì)胞Von kossa染色呈陰性（200×）。見圖5。

3 討論

圖5 Von Kossa染色

間充質(zhì)干細(xì)胞呈纖維狀，是多能干細(xì)胞中的一種［2］。它具有高度自我更新能力和多向分化潛能，能在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，已應(yīng)用于臨床治療急性移植物抗宿主病、缺血性心臟病、缺血性腦病等，安全有效［3］。MSCs在骨髓組織中含量最為豐富，但骨髓取材困難，供者難以接受，來源受到限制，而且隨著年齡的老化，骨髓源MSCs細(xì)胞數(shù)量及增殖分化潛能顯著下降，并且存在病毒感染的潛在危險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞貼壁法分離、培養(yǎng)UC－MSC，細(xì)胞形態(tài)以梭形類纖維樣為主，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第三代UC－MSC表面抗原，CD31和CD45幾乎無表達(dá)，CD44陽性率93.5%，CD73陽性率40.0%，成骨與成脂定向誘導(dǎo)分化，鑒定陽性，說明本實(shí)驗(yàn)方法可得到純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞［4］。

UC－MSC目前已可穩(wěn)定地在體外分離，并且擴(kuò)增迅速，已無來源及數(shù)量上的限制，而低免疫原性、支持造血及多向分化潛能的特點(diǎn)使其有著廣泛的應(yīng)用前景，在細(xì)胞替代治療及組織工程方面有極大的應(yīng)用價(jià)值，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等的治療帶來了新的希望。

［1］Plttenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchvmal stem cells［J］.Science，1999，284（5411）：143.

［2］Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow ［J］.Nature，2002，418 ：41.

［3］Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long－term follow－up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem cells，2010，28：1099.

［4］Deans RJ，Mlseley AB.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2000，28（8）：875.