人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)向造血細(xì)胞分化的研究

陳 曉，馬洪喜，李 丹，韓秀麗，張福明，白 歐＊

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院1.腫瘤中心；2.臨床病理診斷中心，吉林 長(zhǎng)春130021）

骨髓中主要存在兩種干細(xì)胞：造血干細(xì)胞（HSC）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），后者是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，能分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等［1］。它們均起源于中胚層細(xì)胞，MSC能否向造血干／祖細(xì)胞分化，在胚胎造血組織發(fā)生的研究過(guò)程中，不排除由正處于分化中及分化程度很低的幼稚MSC在一定的微環(huán)境的調(diào)控下向多能造血干細(xì)胞分化［2］。目前有關(guān)MSC向造血分化的研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)首先建立人骨髓MSC分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增體系，以hMSC注射于亞致死劑量射線照射后的裸鼠，觀察hMSC體內(nèi)造血分化潛能和造血重建能力，為hMSC作為干細(xì)胞移植供體來(lái)源的可能性和干細(xì)胞橫向發(fā)育的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取本院腫瘤中心健康志愿者骨髓，DMEM－LG、DMEM－HG、胎牛血清（FBS）、Percoll分離液（Phamacia），CD45－FITC、CD34－PE、CD29－PE、CD44－PE、CD90－FITC、CD105－PE（BD），BALB／C－nu／nu裸鼠，6－8周齡，體重18－20g，雌性，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定

將無(wú)菌肝素化骨髓制備成單個(gè)核細(xì)胞（MNC），以1×106／ml的密度接種于培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化傳代，傳至第4代（P4）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取P5代細(xì)胞，消化洗滌后制成1.0×106／ml的單細(xì)胞懸液，分別加入抗CD34、CD45、CD29、CD44、CD90、CD105單克隆抗體，F(xiàn)ACS檢測(cè)MSC表面抗原表達(dá)。

1.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在亞致死劑量射線照射BALB／C－nu／nu裸小鼠體內(nèi)的造血分化潛能

1.3.1 取生長(zhǎng)良好的P5代hMSC，常規(guī)消化洗滌后，收集細(xì)胞濃度為（0.8－1）×107／ml。細(xì)胞分離后冰上保存，盡快輸注。

1.3.2 BALB／C－nu／nu裸鼠給予60Coγ射線全身照射，照射劑量為3.5Gy，照射劑量率為750cGy／min，照射后的裸鼠隨機(jī)進(jìn)行分為2組，每組10只，6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行移植，實(shí)驗(yàn)組輸注hMSC細(xì)胞，輸注量為（1.6－2）×106／只。對(duì)照組輸注PBS 0.2ml。

1.3.3 移植后每日觀察裸鼠外觀、活動(dòng)狀況、毛發(fā)、大小便及攝食情況，每周測(cè)量體重，斷尾取血20μl進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4 骨髓病理及免疫組化分析 實(shí)驗(yàn)組移植后存活至第8周的裸鼠或?qū)φ战M裸鼠在瀕死時(shí)摘除眼球放血處死，剪下雙側(cè)股骨骨骺端，脫鈣后，10%中性甲醛固定，石蠟包埋、脫水、透明，常規(guī)切片后HE染色，顯微鏡下觀察。骨髓病理切片以鼠抗人CD34和CD45單抗為標(biāo)記進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3.5 骨髓細(xì)胞粒－單／巨噬系集落形成單位（CFU－GM）的培養(yǎng) 處死裸鼠后剪下雙下肢，分離雙側(cè)股骨和脛骨，以IMDM培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，加入含rhGM－CSF甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系，置于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)14天后，觀察集落形成情況。

1.3.6 FACS檢測(cè)人源細(xì)胞含量 取裸鼠1×106個(gè)骨髓細(xì)胞加入FITC－mouse anti hu CD45／PE－mouse anti hu CD34，同型對(duì)照為FITC－mouse IgG1／PE－mouse IgG1，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，聯(lián)機(jī)專用軟件Cell Quest分析，結(jié)果以FITC－PE雙參數(shù)曲線圖表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定

擴(kuò)增后的hMSC呈梭形或多角形，成平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)，胞漿淡染，核大、居中，核染色質(zhì)粗，并可見雙核細(xì)胞。經(jīng)FACS檢測(cè)，成人骨髓來(lái)源的 MSC主要表達(dá)黏附分子CD29、CD44、CD90、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45，細(xì)胞均一性達(dá)90%以上。

2.2 照射及移植后祼鼠外觀及白細(xì)胞計(jì)數(shù)

照射后裸鼠一般狀態(tài)較差，體形明顯消瘦，進(jìn)食減少，毛色變暗，對(duì)照組從第2周至第4周，陸續(xù)死亡，而實(shí)驗(yàn)組除3只意外死亡外，均存活至8周，實(shí)驗(yàn)組裸鼠9－12d后狀態(tài)逐漸恢復(fù)至正常。照射后第1周兩組裸鼠白細(xì)胞數(shù)明顯下降，對(duì)照組裸鼠白細(xì)胞數(shù)呈持續(xù)下降趨勢(shì)，直至全部死亡。實(shí)驗(yàn)組裸鼠白細(xì)胞數(shù)在第2周開始恢復(fù)，至第6周白細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常。

2.3 對(duì)移植后存活8周和對(duì)照組的裸鼠進(jìn)行骨髓病理學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)組裸鼠骨髓增生活躍，可見各期幼稚細(xì)胞。對(duì)照組裸鼠骨髓病理顯示骨髓細(xì)胞增生低下，造血面積減少，非造血細(xì)胞增多（圖1－2）。免疫組化結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠的骨髓中可以檢測(cè)到CD34陽(yáng)性和CD45陽(yáng)性的細(xì)胞，細(xì)胞呈局灶性分布，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿及胞膜呈棕黃色（圖3－4）。而對(duì)照組裸鼠的骨髓細(xì)胞中未檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞。

2.4 骨髓細(xì)胞粒－單／巨噬系集落形成單位（CFUGM）的培養(yǎng)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組裸鼠的骨髓細(xì)胞在含rhGM－CSF甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系培養(yǎng)14天后，可見少量的密集型集落形成（圖略）。

2.5 FACS檢測(cè)人源細(xì)胞含量

經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，實(shí)驗(yàn)組裸鼠骨髓中可以檢測(cè)到CD34陽(yáng)性和CD45陽(yáng)性的細(xì)胞，陽(yáng)性百分率分別為4.63%±0.57%和0.87%±0.12%（圖略），而對(duì)照組未檢測(cè)到CD34陽(yáng)性和CD45陽(yáng)性的細(xì)胞。

3 討論

大量的研究證實(shí)，成體干細(xì)胞不僅僅是一種“定向干細(xì)胞”（Commited stem cells），即只能分化為其所起源或定居組織的特定細(xì)胞類型，同時(shí)它能夠分化為其他組織細(xì)胞類型。研究表明，MSC已不再局限于其支持和維持體內(nèi)外造血的功能［3］，不僅可在體內(nèi)、體外分化為中胚層來(lái)源的細(xì)胞，也可以分化為外胚層來(lái)源的神經(jīng)樣細(xì)胞，而且在一定的微環(huán)境的調(diào)控下向多能造血干細(xì)胞分化，發(fā)育成各系造血細(xì)胞，但應(yīng)有適合于復(fù)制和分化的基質(zhì)即“生態(tài)龕”的存在［2］。推測(cè)MSC可能是造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的公共干細(xì)胞（Common stem cells），即MSC同樣具有向造血細(xì)胞分化的潛能。呼瑩等將擴(kuò)增后的雄性小鼠骨髓MSCs輸注給預(yù)先經(jīng)致死劑量照射的雌性小鼠，輸注后的第3周，外周血和骨髓中的有核細(xì)胞都明顯恢復(fù)，數(shù)天后通過(guò)PCR方法特異性地?cái)U(kuò)增Y染色體的sry基因，確定在重建造血的小鼠體內(nèi)，造血細(xì)胞大部分來(lái)源于供體 MSC［4］。Porada等研究發(fā)現(xiàn)將表型為 CD90＋、CD44＋、CD29＋、CD106＋、CD45－、STRO－1＋MSC進(jìn)行羊?qū)m內(nèi)羊胎移植，借助于胚胎微環(huán)境，MSC能分化為造血細(xì)胞和肝細(xì)胞，盡管檢出率不高，但這種MSC來(lái)源的細(xì)胞能在體內(nèi)存活長(zhǎng)達(dá)半年以上而無(wú)任何毒性反應(yīng)［5］。

圖1 實(shí)驗(yàn)組裸鼠骨髓病理（×100）

圖2 對(duì)照組裸鼠骨髓病理（×100）

圖3 實(shí)驗(yàn)組骨髓病理免疫組化CD34陽(yáng)性（×1000）

圖4 實(shí)驗(yàn)組骨髓病理免疫組化CD45陽(yáng)性（×1000）

本實(shí)驗(yàn)將體外分離擴(kuò)增的hMSC移植給亞致死劑量照射后的裸鼠，移植后第1周裸鼠白細(xì)胞數(shù)值下降明顯，實(shí)驗(yàn)組移植后第6周，外周血白細(xì)胞明顯恢復(fù)并接近正常水平。骨髓病理結(jié)果顯示，移植后8周，實(shí)驗(yàn)組裸鼠骨髓細(xì)胞增生活躍，可見各個(gè)階段的細(xì)胞。同時(shí)我們以CD34、CD45作為標(biāo)記，通過(guò)FCM、免疫組化的方法檢測(cè)人源性造血細(xì)胞的植入情況，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組骨髓可以檢測(cè)到CD34和人CD45陽(yáng)性的細(xì)胞，體外造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)移植受體小鼠骨髓中存在人源性造血干／祖細(xì)胞。說(shuō)明hMSC能在亞致死劑量射線照射的裸鼠骨髓中植入并分化表型為人CD34＋的造血干／祖細(xì)胞，重建造血。

HSCT作為一種重要的生物或細(xì)胞治療，盡管已取得了令人鼓舞的臨床療效，但供源不足、原始造血干細(xì)胞能否大量擴(kuò)增仍存爭(zhēng)議以及移植物中腫瘤細(xì)胞的污染等使得HSC在數(shù)量和質(zhì)量上遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。相比之下，MSC來(lái)源廣、易于分離和體外培養(yǎng)，并且在體外易于大量擴(kuò)增，本研究結(jié)果證實(shí)MSC可以分化為造血細(xì)胞，MSC以貼壁的方式生長(zhǎng)，而白血病細(xì)胞主要以懸浮的方式生長(zhǎng)，那么，我們可以從白血病患者骨髓中分離出MSC，通過(guò)貼壁和體外反復(fù)消化傳代培養(yǎng)，大量擴(kuò)增的同時(shí)也可清除移植物中的白血病細(xì)胞以達(dá)到凈化移植物的目的，MSC不僅可分化為造血干／祖細(xì)胞重建造血，而且能在一定程度上減少術(shù)后復(fù)發(fā)，因此MSC有望成為HSC的新來(lái)源，MSC移植將具有更廣泛的應(yīng)用前景。

［1］Yuchua J，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］.Nature，2002，418（6893）：41.

［2］施斐曼，劉 永.造血干細(xì)胞發(fā)生學(xué)研究－人胚肝造血干細(xì)胞［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1982，4：15.

［3］Linzhao CH，Qasba P，Vanguri P，et al.Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro－platelet formation from CD34＋ hematopoietic progenitor cells［J］.Cell Physiol，2000，184（1）：58.

［4］呼 瑩，馬 麗，馬冠杰，等.具骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞移植造血［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，24（1）：20－24.

［5］Porada GA，Brouard N，et al.Generation of hematopoietic and hepatic cells by human bone marrow stromal cells in vivo［J］.Blood.2001，96（11）：57.