間接熒光染色－流式細胞術檢測細胞內磷酸化Erk1／2

潘 敏，王 海，張 鐸，李 妍＊

（1.武警吉林省總隊醫院，吉林 長春130052；2.吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033；3.吉林醫藥學院免疫學與病原學教研室，吉林 吉林132013）

絲裂源活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）家族參與細胞生長、增殖、分化和凋亡等重要過程。MAPK家族成員p42／44MAPK（Erk1／2）在生長因子、細胞因子、營養物質和能量刺激下活化，促進細胞增殖或抵抗凋亡；Erk1／2分子中Thr202和Tyr204位氨基酸殘基的磷酸化是其活化的標志［1］。經典的檢測蛋白激酶表達與磷酸化的方法是蛋白印跡（western blotting，WB）技術，但 WB步驟繁瑣，所需時間長，技術難掌握。流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測細胞內細胞因子方法的建立，啟發了人們探索應用FCM檢測細胞內蛋白激酶。有學者應用直接熒光染色來分析細胞內蛋白激酶，但以間接熒光染色檢測蛋白激酶的則未見報道［2］。本研究優化了細胞固定、打孔和洗滌等條件，采用非標記的一抗和熒光素標記二抗聯合標記，即間接熒光染色－流式細胞術分析細胞內磷酸化Erk1／2，所建立的檢測方法可獲得強而特異的信號。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞A549引自美國典型物種保藏中心，Erk1／2的抑制劑PD98059購自Sigma公司（美國）。1640培養液購自GBICO公司（美國），小牛血清購自浙江黃巖四季青生物技術公司。β－actin、Erk1／2、磷酸化 Erk1／2（p－Erk1／2）（磷酸化位點為Thr202和Tyr204），購自Cell signaling公司（美國），3種抗體均為兔多抗。FITC標記二抗和HRP標記二抗購自中杉公司（北京）。PVDF膜、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒和兔IgG購自碧云天生物技術研究所（上海）。

1.2 細胞培養

用含10%小牛血清的1640培養液，在5%CO2、37℃和飽和濕度條件下培養A549細胞，取對數生長期細胞用于實驗。接種細胞于培養瓶，以含3%小牛血清的1640培養液培養細胞6小時后分組為：繼續以3%小牛血清的培養液培養；添加血清至10%繼續培養；加血清至10%但同時加不同濃度PD98059（10、20和40μmol）。培養12小時后，消化收集細胞并完成后續實驗。

1.3 蛋白印跡技術

每組取1×107個細胞，提取細胞總蛋白，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉于PVDF膜后室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2小時，將膜分別與一抗β－actin（1∶2 000）、Erk1／2（1∶1 000）、p－Erk1／2（1∶1 000）在4℃下反應過夜。次日，用含0.5%Tween 20的TBS洗3次，再加入二抗（HRP標記）并孵育2小時，室溫下用0.5%Tween 20／TBS洗膜3次后ECL發光。

1.4 間接標記和流式細胞術分析

如下方法進行p－Erk1／2（1∶100）的間接免疫熒光染色，以10μg／ml的兔IgG為同型對照（isotype control）。①PBS洗滌細胞2次，采用4%的多聚甲醛固定30分鐘；②PBS洗滌后用含1% 的Triton X－100和0.5%小牛血清的PBS處理細胞30分鐘（打孔和封閉）；③含0.5%Triton X－100、0.05%Tween 20的PBS稀釋一抗或兔IgG，與細胞在室溫下反應30分鐘；④含0.5%Triton X－100、0.05% 的Tween 20的PBS洗滌細胞2次；⑤2%的多聚甲醛固定10分鐘后洗滌細胞1次；⑥用含0.5%Triton X－100、0.05% 的Tween 20的PBS稀釋二抗（FITC－標記鼠抗兔抗體），在室溫下反應30分鐘；⑦含0.5%Triton X－100、0.05%Tween 20的PBS洗滌細胞2次，500μl的2%多聚甲醛固定細胞，FCM分析FITC熒光。

2 結果

2.1 蛋白印跡檢測A549細胞內Erk1／2表達及磷酸化

WB分析發現，低血清饑餓細胞在10%血清刺激后Erk1／2表達增加、磷酸化增強；PD98059以濃度依賴的方式抑制Erk1／2磷酸化，但對其表達無影響（圖1）。其中泳道“1”為低血清饑餓組，“2”為10%血清刺激組，而“3－5”分別為血清刺激后添加不同濃度PD98059組（10、20和40μmol）。

2.2 流式細胞術檢測細胞A549細胞Erk1／2磷酸化

以兔IgG染色為同型對照來設置檢測條件和陰性“門”位置（圖2A），與低血清饑餓組比較（圖2B），10%血清刺激組熒光強度增加（圖2C）；隨Erk1／2抑制劑濃度增加（（10、20和40μmol）），細胞的熒光強度下降（圖2D－F）。

圖2 FCM分析A549細胞內Erk1／2磷酸化

3 討論

信號轉導是細胞生物學、腫瘤和藥學等領域研究的熱點內容，研究信號轉導通路需要分析通路中各信號分子的變化，其中許多信號分子是蛋白激酶。例如，Erk1／2、p38MAPK 和JNK 等屬 于 MAPKs家族。蛋白激酶分子通常含多個可被磷酸化的氨基酸殘基，即磷酸化位點；不同位點的磷酸化與蛋白激酶的活化、結合底物或泛素化降解密切相關［3］。例如，Erk1／2分子Thr202和Tyr204磷酸化后，其活性增加。WB是檢測蛋白激酶總量和磷酸化的基本方法，但存在步驟多、技術難掌握和需要樣品量多等缺點［4］。目前，應用直接熒光染色和流式細胞術分析蛋白激酶磷酸化的方法已經建立，具有操作簡單及可準確定量的優點。由于蛋白激酶多為細胞內蛋白，商品化試劑中熒光素標記的一抗較少，若建立間接熒光染色和流式細胞術檢測磷酸化蛋白激酶，則可實現對更多蛋白激酶的快速、準確分析。本研究優化了關鍵條件，包括細胞膜打孔、封閉、洗滌和“抗體－激酶”的固定，獲得了與直接標記一致的強而特異的信號［5］。所建立流式細胞術分析方案可實現細胞內磷酸化激酶的敏感、快速分析。

［1］Stan D，Calin M，Manduteanu I，et al.High glucose induces enhanced expression of resistin in human U937monocyte－like cell line by MAPK－and NF－kB－dependent mechanisms；the modulating effect of insulin［J］.Cell Tissue Res，2011，343（2）：379.

［2］陳朱波，曹雪濤.流式細胞術：原理、操作及應用［M］.北京：科學出版社，2010.

［3］Feldman ME，Shokat KM.New inhibitors of the PI3K－AktmTOR pathway：insights into mTOR signaling from a new generation of Tor Kinase Domain Inhibitors（TORKinibs）［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010，347：241.

［4］Han Y，Guo Q，Zhang M，et al.CD69＋ CD4＋ CD25－T cells，a new subsetof regulatory T cells，suppress T cell proliferation through membrane－bound TGF－beta 1［J］.J Immunol，2009，182（1）：111.

［5］Albu DI，Califano D，Avram D.Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes［J］.Methods Mol Biol，2010，647：377.