抑制性ODN對潰瘍性結腸炎患者腸黏膜單個核細胞分泌細胞因子的影響

孫 鵬，周曉晶，劉伯巖，楊文穎＊

（1.吉林省人民醫院 消化內科，吉林 長春130021；2.長春中醫藥大學基礎醫學院 生物化學與分子生物學教研室，吉林 長春130117）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種以結直腸黏膜慢性感染導致潰瘍為特征的慢性炎癥。盡管對該疾病的發病機制研究了很多年，但是至今仍不清楚。目前潰瘍性結腸炎的治療以SASP和糖皮質激素為主，但其療效欠佳且副作用大。因此急待開發一種新的藥物來治療潰瘍性結腸炎。據報道，潰瘍性結腸炎的發生與結腸黏膜細胞表達TLR9密切相關［1］，當TLR9與細菌的CpG ODN結合后會激活NF－κB途徑進而促進免疫細胞和腸黏膜細胞分泌與潰瘍性結腸炎發病密切相關的細胞因子IL－8，TNF－α等［2］。因此抑制TLR9與細菌CpG ODN的結合或許是治療潰瘍性結腸炎的一個新靶點。抑制性ODN是TLR9的抑制劑，目前已發現其在系統性紅斑狼瘡、膿毒血癥等一些TLR9過度表達的自身免疫性疾病的治療研究中顯示了巨大的發展潛力［3，4］。但用ODN來抑制潰瘍性結腸炎的研究還未見報道。因此本研究將探討抑制性ODN對潰瘍性結腸炎患者腸黏膜固有層單個核細胞細胞因子表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ODNs 純化的單鏈寡聚脫氧核苷酸購自日本Takara大連分公司（OPC級，純度90%，HPLC級，純度99%）。本研究使用的ODNs序列如下：2216 （5′－GGGGGACGATCGTCGGGGGG－3′），A151 （5′－TTAGGGTTAGGGTTAGGGT－TAGGG－3′）。所有的CpG ODNs被溶于無菌PBS中，紫外分光光度計定量，檢測內毒素＜0.03EU／mg，符合實驗要求，于－20℃冷藏備用。

1.1.2 本研究納入在吉林省人民醫院消化內鏡中心經腸鏡檢查的10例潰瘍性結腸炎患者。每例患者各取5塊活檢組織，立即浸泡于D－Hanks緩沖液中待用。

1.1.3 人 TNF－α、IL－8檢測試劑盒購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司。Trizol RNasin購自大連寶生物工程有限公司。PCR引物由上海生工合成。oligo dT購自上海生工。AMV及AMV Buffer購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 腸黏膜固有層單個核細胞株（LPMC）的分離 分離方法如文獻所述［5－6］。用10mM／L DTT溶液作用于活檢標本30min，然后用10mM／L的EDAT溶液作用30分鐘以去除上皮，此步驟重復2－4次至溶液中觀察不到上皮細胞。然后用10ml消 化 酶 （0.02% 酶，0.01%DNase，25Mm／L HEPES）于37℃水浴，5h后用濾網過濾，收集溶液，12 000rpm離心5min，去上清，用 D－Hanks液重新浸泡，用巴氏管在其底部緩慢加入淋巴細胞分離液。密度梯度離心，28 000rpm離心30min，巴氏管小心吸取出分層處細胞約1－2ml，將其離心，12 000rpm離心5min，棄上清。用1mL 1640溶解細胞，混勻后臺盼藍染色、計數待用。

1.2.2 培養LPMCs及A151干預 將分離得到的LPMCs培養于1640培養液中，37℃，5%CO2孵箱內培養。3h后，接種于24孔培養板上，每孔1mL（細胞濃度：1×106／mL）。進行如下培養：medium組（無干預，無2216刺激）；2216組（無干預，6μg／mL 2216刺激）；medium＋PBS組（以PBS干預，無2216刺激）；2216＋PBS組（以PBS干預，有2216刺激）；medium＋A151組（以A151干預，無2216刺激）；2216＋A151組（以A151干預，有2216刺激）；medium＋DEX組（以DEX干預，無2216刺激）；2216＋DEX組（以DEX干預，有2216刺激）。每組設三復孔，培養48小時后，收集細胞及上清液，－70℃凍存備用。上清液用于ELISA檢測，凡是有2216刺激的細胞用于RT－PCR檢測。

1.2.3 細胞培養上清中的細胞因子水平檢測 根據試劑盒說明書應用ELISA法檢測培養上清中的IL－8和 TNF－α的水平。

1.2.4 細胞中IL－8和 TNF－αmRNA 表達的檢測 參照TRIzol試劑說明書提取LPMC的總RNA，逆轉錄后進行PCR反應，檢測IL－8和TNF－α基因mRNA的表達。

1.2.5 統計學處理 所得數據采用均數±標準差（±s）表示，各組數據進行正態檢驗及方差齊性檢驗，采用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 A151對潰瘍性結腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的影響

分離患者的 LPMCs，將其與 medium、2216（1 μg／ml）共同孵育，并用A151和DEX加以干預。48 h后，ELISA法檢測培養上清中的IL－8和TNF－α的表達情況。結果如表1所示，與medium相比，2216能明顯地刺激LPMCs分泌IL－8和TNF－α（P＜0.05）（圖1）。而用A151和DEX加以干預后，與PBS組相比，兩者均能抑制IL－8和TNF－α的分泌（P＜0.05），但是A151的抑制作用明顯強于DEX（P＜0.05）（圖1）。

表1 A151對潰瘍性結腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的影響

2.2 A151對TNF－αmRNA及IL－8mRNA表達的影響

分離患者的LPMCs，將其與 medium、2216（1 μg／ml）共同孵育，并用A151和DEX加以干預。48 h后，收集LPMCs。提取LPMCs的RNA，分別以TNF－α和IL－8的引物進行 RT－PCR反應，PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖2所示，DEX和A151均能抑制TNF－α和IL－8的mRNA的表達，但A151的抑制作用更強。

圖1 A151對潰瘍性結腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的抑制作用

圖2 A151對TNF－α和IL－8的mRNA表達的抑制作用

3 討論

根據潰瘍性結腸炎的發病機理－炎性細胞因子尤其是 TNF－α、IL－1β和IL－8的高表達與潰瘍性結腸炎的發生高度相關［7－8］，而且有研究表明正常人的腸黏膜單個核細胞與潰瘍性結腸炎病人的腸黏膜單核細胞內均可檢測到TLR9的表達［9］，TLR9是多表達于免疫細胞內的Toll樣受體家族的成員之一，其配體為細菌DNA或含CpG的寡聚脫氧核苷酸［2］。一旦TLR9與其配體相結合，可經 NF－κB途徑刺激細胞因子的分泌。潰瘍性結腸炎病人腸黏膜細胞可表達TLR9，而且疾病的發生與細胞因子有關，這說明潰瘍性結腸炎的發生或許是TLR9被激活，進而導致炎性因子的分泌，從而誘發了腸黏膜的炎癥［10］。因此抑制TLR9的活化，拮抗其配體與其結合或許是治療該疾病的一個新途徑。因此，本研究利用抑制性ODN是TLR9的抑制劑這一特點，探索其是否具有治療潰瘍性結腸炎的潛力。結果發現，抑制性ODN能夠抑制潰瘍性結腸炎患者腸黏膜單個核細胞分泌TNF－α及IL－8，而且能抑制這兩種細胞因子mRNA的表達。因此本研究為研發新的治療潰瘍性結腸炎的藥物提供了思路和實驗依據。

［1］何 雁，王啟之.Toll樣受體9與潰瘍性結腸炎［J］.安徽醫藥，2009，13（6）：593.

［2］Krieg AM.CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects［J］.Annu Rev Immunol，2002，20：709.

［3］Chunyan He，Lei Zhou，Ran Sun，et al.Effects of oligodeoxynucleotide with CCT repeats on chronic graft versus host disease induced experimental lupus nephritis in mice［J］.Clinical Immunology，2011，140（3）：300.

［4］Ran Sun，Luguo Sun，Musheng Bao，et al.A human microsatellite DNA－mimicking oligodeoxynucleotide with CCT repeats negatively regulates TLR7／9－mediated innate immune responses via selected TLR pathways［J］.Clinical immunology，2010，134（3）：262.

［5］Bull DM，Bookmna MA，Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal mononuclear cells［J］.Clin Invest，1977，59：966.

［6］劉小方，歐陽欽，黃麗彬，等.結腸粘膜活檢標本中固有層單個核細胞的分離及表型分析［J］.華西醫科大學學報，2000，31：116.

［7］李貞娟，張彩鳳，夏永華，等.潰瘍性結腸炎患者外周血單個核細胞TLR4的表達及其與TNF－α和IL－6的相關性［J］.廣東醫學，2011，32（9）：1166.

［8］張超賢，秦詠梅.潰瘍性結腸炎患者血清腫瘤壞死因子－α、白細胞介素－8水平變化及其臨床意義［J］.西安交通大學學報（醫學版），2009，30（5）：646.

［9］G.Pedersen，L.Andresen，M.W.Matthiessen，J.Rask－Madsen and J.Brynskov.Expression of Toll－like receptor 9and response to bacterial CpG oligodeoxynucleotides in human intestinal epithelium［J］.Clinical and Experimental Immunology，2005，1141：298.

［10］Jongdae Lee，Jose M，Gonzales－Navajas，et al.The“polarizingtolerizing”mechanism of intestinal epithelium：its relevance to colonic homeostasis［J］.Immunopathol，2008，30：3.