兒茶酚O－甲基轉移酶基因多態性分析方法探討

趙曉苗，趙一凡，趙宇正，趙煒疆，唐雪蓮，謝梅青＊

（1.中山大學孫逸仙紀念醫院a.婦產科；b.麻醉科，廣東 廣州510120；2.肇慶市第一人民醫院；3.汕頭醫學院神經科學中心；4.深圳市婦兒醫院）

多聚酶鏈反應－限制性片段長度多態性 （Polymerase－chain reaction－restriction fragment length Polymorphism，PCR－RFLP）是傳統的檢驗基因多態性的方法，根據酶切圖譜判斷基因型［］。變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）是一種基于 WAVE系統分析的新高通量篩選DNA序列變異的技術，原理是用離子對反向高效液相色譜法分離并檢測異源雙鏈，目前已用于基因序列的比較、人類基因多態性及疾病相關性的研究［2］。本研究采用RFLP和DHPLC分析兒茶酚O－甲基轉移酶 （catachol－O－methyltransferase，COMT）基因的第4號外顯子第158位密碼子G／A的多態性，并結合DNA測序法比較兩種方法的可行度、可信度和優缺點。

1 材料和方法

1.1 研究對象 病例組選擇1999年11月－2004年11月收治我科經病理確診的50例子宮內膜癌患者，其中18例收集蠟塊包埋組織，32例抽取全血；對照組選擇同期收治經病理確診子宮脫垂并排除其他婦科疾病的患者，其中31例蠟塊包埋組織，19例抽取全血。兩組病人均大于40歲，為我國漢族人，被抽取血標本的患者全部知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的制備：① 采用無菌ddH《》2O 和PBS液提取白細胞后，用DNA提取液（達安基因公司提供）提取全血基因組DNA。②蠟塊包埋組織的DNA提取：切取8μm蠟塊切片8張，二甲苯脫蠟，TE9提取液消化，等體積酚－氯仿溶液抽提3次，無水乙醇沉淀DNA。TE9提取液制備：500mmol／L Tris，20mmol／L EDTA，10mmol／L NaCL，1%SDS，500μg／ml蛋白酶 K，PH8.0。

1.2.2 PCR擴增：參照文獻［3］設計引物，為使兩條引物的Tm值更接近，在前引物5’端置換1個堿基。序列為5’－TGCTGTGGCTACTCAGCTGTG－3’，5’－TGAACGTGGTGTGAACACCTG－3’。 反應體系為：10＊PCR buffer 5μL，d NTP Mixture（各2.5mM）4μL，一對引物（各50mM）各0.5－1 μL，模板 DNA（0.1－0.5μg）5μL，Taq酶0.5u，dd H2O加至50μL。反應條件：94℃5min，94℃30 s，67℃（蠟塊包埋組織DNA）或64℃（全血DNA）30s，72℃1min，30個循環，72℃延伸7min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.2.3 酶切反應 取PCR產物10μL，NiaⅢ 酶（5U）0.5μL，37℃孵育3h行酶切反應。采用20%非變性聚丙烯酰胺凝膠行酶切產物電泳，據酶切圖譜判斷基因型。

1.2.4 變性高效液相色譜分析：WAVE系統分析的基本流程：部分變性溫度在接近DNA解鏈溫度（Tm）附近進行檢測，將DNA序列及選擇檢驗的方式輸入計算機，軟件系統自動模擬選擇最佳分離梯度，每次上樣5μL。上樣PCR產物被流動相以0.9 mL.min－1的速度帶至DNA分離柱進行目的DNA片段分離，分析一個樣品需要8min左右。第一次上樣：WAVE峰圖有兩種峰型，單峰代表被分離的DNA片段為純合基因型，雙峰代表雜合基因型。第二次上樣：以測序證實的COMT野生型純合子（COMTVal／Val）為對照，把 COMTVal／ValPCR產物與等量的單峰樣品混合行DHPLC分析。如仍為單峰，說明被檢測樣品是COMTVal／Val，如為雙峰，說明被檢測樣品為 COMTMet／Met。

1.2.5 DNA變異的序列測序鑒定：隨機抽取20例PCR產物交上海博亞廣州分公司測序（AB 3700自動激光熒光測序儀）。

1.2.6 統計方法：采用SPSS12.0統計軟件，采用χ2檢驗比較兩組的COMT基因型頻率分布，Kappa統計量分析PCR－RFLP以及DHPLC法和測序方法的一致性。

2 結果

2.1 PCR結果 擴增的PCR產物為237bp。本組所有血標本均可一次擴增成功。個別蠟塊標本需要在跑完第一次PCR后，把目的條帶切割回收，再跑一次PCR，以提高產物純度，最終可順利行酶切反應。

2.2 RFLP分析結果 所有PCR產物均可進行酶切反應，NiaⅢ酶辨認CATG回文序列切割，得到片段見表1。

表1 酶切片段結果

酶切圖見圖1。與DNA測序（見圖2）驗證的結果比較（表1），Kappa值＝0.697，P＝0.000，有統計學意義，認為RFLP法與測序法的一致性好。

2.3 DHPLC結果 全部血標本擴增的PCR產物可行DHPLC分析，但只有小部分蠟塊包埋組織的PCR產物可行DHPLC分析。第一次上樣分離的單峰為 COMTVal／Val或 COMTMet／Met（圖3），雙峰為COMTVal／Met（圖4）。第二次上樣的雙峰為 COMTMet／Met（圖5）。DHPLC法與測序法驗證的結果比較（表2），Kappa值＝0.924，P＝0.000，有統計學意義，可以認為DHPLC法與測序法的一致性極好。

圖1 COMT基因擴增產物經Nla酶切后的電泳圖

圖2 COMTVal／Met基因測序圖

圖3 第一次上樣的COMTVal／Val和COMTMet／Met WAVE峰圖

2.4 子宮內膜癌組與對照組COMT基因型的頻率比較 采用RFLP法檢測結果比較子宮內膜癌組和對照組的COMT基因多態性分布（見表3）［4］。對照組以 COMTVal／Val基因型為主（48.0%），COMTVal／Met（44.0%）和 COMTMet／Met（8.0%）次之；子宮內膜癌組則以COMTVal／Met基因型（58.0%）為主，但差異無統計學意義。

圖4 第一次上樣時的COMTVal／Met和對照物的WAVE峰圖

圖5 兩種純合子加入對照物（COMTVal／Val）混合后的WAVE峰圖

表2 PCR－RFLP以及DHPLC法和測序法的一致性分析

表3 子宮內膜癌組與對照組的COMT基因型的頻率分布比較

3 討論

以往普遍應用RFLP分析COMT基因多態性，RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點發生堿基突變或酶切位點之間插入或缺失堿基導致酶切片段大小發生變化，顯示為不同的酶切圖譜，從而判讀基因型，廣泛應用于單核甘酸多態性檢測，基因組遺傳圖譜構建，基因定位以及生物進化和分類的研究［5］。本研究原計劃收集全血提取DNA進行COMT基因多態性的分析，后來由于時間受限、樣本數目受限制，增加了病理科庫存的蠟塊包埋組織，從中提取的DNA基本可以滿足PCRRFLP的應用需要。

然而RFLP法存在非特異性切割現象和對多個切割位點有個別切不開的問題，且小片段DNA可能在聚丙烯酰胺電泳過程中降解，操作較繁瑣；據酶切片段的多少和大小，敏感性不一，檢出率約16.3%－100%［6］。本組全血標本和蠟塊包埋組織雖然可以全部提取出DNA，但由于COMT基因目的PCR片段為236bp，酶切為4－6個片段，每個片段都較小，故存在一定的誤差。與測序法比較，Kappa值＝0.697，認為兩法的一致性好，RFLP法基本可以用于COMT基因多態性的分析，均適用于全血和蠟塊包埋組織。

DHPLC能以三種方式操作：（1）在不變性溫度下，色譜儀類似凝膠電泳儀，分離分子量不同的雙鏈DNA分子。（2）在充分變性溫度下，區分單鏈DNA或RNA分子。（3）在部分變性的溫度下，識別變異型和野生型的PCR產物：雜合子和純合子PCR產物在部分變性的溫度下，分別形成同源雙鏈和錯配形成異源雙鏈，異源雙鏈由于堿基對不匹配，會在不匹配的堿基對處部分解鏈，比同源雙鏈先洗脫出來［7］，根據柱上的保留時間不同可以分辨異源雙鏈與同源雙鏈識別雜合子型。本研究是在部分變性溫度下檢測基因突變，該種方式主要應用于基因突變檢測、單核苷酸多態性分析（SNPs）和短片段串聯重復序列分析（STRs）等方面。

其他學者認為，DHPLC法分析單核甘酸多態性，具有自動化，快速（一個樣品約需8.8分鐘），操作簡便，檢出率高達95%－100%［6］，檢出 DNA 片段大小范圍廣等優點。本組研究對于血標本擴增的PCR產物，DHPLC法檢出率為100%，通過與測序法比較，Kappa值＝0.924，認為兩法的一致性極好。RFLP和DHPLC相比，都需要經過提取DNA、擴增PCR步驟，RFLP需要酶切反應、跑膠，根據酶切圖譜判斷基因型；DHPLC直接檢測PCR產物，判斷基因型。但DNA分析儀對PCR產物的純度和質量有一定要求，故許多蠟塊包埋組織提取的DNA擴增的PCR產物都不能檢測成功。

綜上所述，DHPLC法更適用于如血標本等DNA質量較好樣本的基因多態性分析，且準確率更高、更簡便，但是在基因多態性和臨床相關性疾病研究中，短時間內不能收集較多血樣本的情況下，需要采用蠟塊包埋組織標本進行分析，傳統RFLP法則不失為一個合適的方法。

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［4］趙曉苗，謝梅青，楊冬梓，等.兒茶酚－O－甲基轉移酶基因多態性與子宮內膜癌遺傳易感性的關系［J］.中華婦產科雜志，2007，42（02）：116.

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