Galectin－3和MMP－14對(duì)膀胱尿路上皮癌血管生成作用的研究

王 曄，劉 巖，張志勇，吉日嗄拉

（1.唐山工人醫(yī)院 泌尿外科，河北 唐山063000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院）

腫瘤中血管生成已經(jīng)得到人們的普遍認(rèn)可，但是引起腫瘤血管生成的因素很多，且其作用機(jī)理并不完全清楚。Galectin－3為凝集素蛋白家族成員之一，分子量31KD，其可參與許多生理和病理過程，主要包括細(xì)胞黏附、生長調(diào)節(jié)、腫瘤的轉(zhuǎn)化和凋亡等［1，2］。基質(zhì)金屬蛋白酶－14（MMP－14）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，也是最重要的激活MMP－2降解細(xì)胞外基質(zhì)的成分，包括各種膠原、蛋白多糖和糖蛋白等，MMP－14的高表達(dá)在腫瘤進(jìn)展中具有一定作用［3］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測膀胱尿路上皮癌中Galectin－3、MMP－14和CD34的表達(dá)特征，探討其關(guān)系及對(duì)判斷預(yù)后的意義，旨在為探討腫瘤的發(fā)展提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 臨床材料

收集2003年1月至2006年10月在唐山市工人醫(yī)院行膀胱尿路上皮癌根治術(shù)后存檔的蠟塊組織作為觀察組。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WHO分類中泌尿系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)主治醫(yī)師確診。②納入患者手術(shù)前均未進(jìn)行任何放、化療；③臨床隨訪資料完整。本組共收集80例，其中男性50例，女性30例，年齡為38－78歲，平均59.7±7.0歲。本組中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為31例。同時(shí)選擇距腫物邊緣＞5厘米處的癌旁正常黏膜組織50例作為對(duì)照組，其中男性31例，女性19例，年齡37－77歲，平均59.5±7.4歲。二組在常規(guī)指標(biāo)的比較中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 Galectin－3、MMP－14和CD34的檢測方法

Galectin－3、MMP－14和 CD34的檢測均采用免疫組織化學(xué)SP法，試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，均由病理科專業(yè)技術(shù)人員完成，嚴(yán)格質(zhì)控。

1.3 Galectin－3、MMP－14和 MVD的判斷方法

所有切片均由病理科兩位主治醫(yī)師閱片并記錄。Galectin－3和 MMP－14陽性表達(dá)部位為細(xì)胞漿，胞漿中有棕褐色顆粒染色為陽性；每個(gè)切片于高倍鏡下隨意取5個(gè)不重復(fù)視野陽性細(xì)胞，以陽性細(xì)胞所占百分比分為三級(jí)：陽性細(xì)胞＜5%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽性，其中陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為弱陽性（＋），≥25%為強(qiáng)陽性（＋＋）。CD34標(biāo)記的微血管管計(jì)數(shù)（MVD）方法：先在低倍鏡下觀察染色的最豐富區(qū)，然后在高倍鏡下分別計(jì)數(shù)，每個(gè)陽性染色的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇或單個(gè)小脈管均視為1個(gè)微血管。每例計(jì)數(shù)4個(gè)視野，取其平均值作為MVD［3］。以 MVD≥25為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，相關(guān)分析應(yīng)用線性相關(guān)分析，并對(duì)患者進(jìn)行生存分析，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Galectin－3、MMP－14和 MVD在觀察組與對(duì)照組中的表達(dá)

Galectin－3和MMP－14在觀察組中表達(dá)的陽性率明顯高于對(duì)照組，觀察組中MVD明顯高于對(duì)照組。見表1。

2.2 Galectin－3、MMP－14和 MVD在觀察組不同臨床病理特征中的表達(dá)差別

觀察組中Galectin－3、MMP－14和 MVD的表達(dá)與腫瘤體積、有無浸潤、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。見表2。

表1 Galectin－3、MMP－14和MVD在觀察組與對(duì)照組中的表達(dá)

表2 Galectin－3、MMP－14和MVD在觀察組不同臨床病理特征中的表達(dá)差別

2.3 觀察組中 Galectin－3、MMP－14和 MVD表達(dá)的關(guān)系

經(jīng)線性相關(guān)分析顯示，觀察組中Galectin－3和MMP－14的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.41，P＝0.0423），Galectin－3和 MVD的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.45，P＝0.0314），MMP－14和 MVD 的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.47，P＝0.0240）。

2.4 觀察組中 Galectin－3、MMP－14和 MVD的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

本組患者隨訪時(shí)間為7－60個(gè)月，平均28.7個(gè)月。Galectin－3、MMP－14和 MVD陽性組和陰性組生存曲線如圖1、2、3所示，經(jīng)檢驗(yàn)，膀胱尿路上皮癌中 Galectin－3（χ2＝18.7728，P＜0.05）、MMP－14（χ2＝23.8157，P＜0.05）和 MVD（χ2＝24.7380，P＜0.05）的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），即 Galectin－3、MMP－14和MVD高表達(dá)患者的預(yù)后差。

圖1 Galectin－3與膀胱癌生存的關(guān)系

圖2 MMP－14與膀胱癌生存的關(guān)系

圖3 MVD與膀胱癌生存的關(guān)系

3 討論

腫瘤形成及發(fā)展過程中的生物學(xué)行為受到人們的廣泛關(guān)注，而腫瘤轉(zhuǎn)移作為腫瘤發(fā)展中的重要因素，成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)。腫瘤中有血管新生，為其生長及血道播散提供了直接證據(jù)。Galectin－3是動(dòng)物血凝素Lectin家族成員之一，因與含有β半乳糖苷殘基的糖復(fù)合物具有很高的親和力而得名［4］。Galectin－3的相對(duì)分子量約為31×103，編碼基因位于染色體1p13及14q21－22，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，因Galectin－3在結(jié)構(gòu)上缺乏轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，因此這種結(jié)構(gòu)具有傳遞信號(hào)的作用。雖然Galectin－3有上述多種作用，但是有觀點(diǎn)認(rèn)為Galectin－3表達(dá)最主要的功能是參與細(xì)胞外黏附與基質(zhì)的反應(yīng)，其可能與 MMPs有協(xié)同作用［5，6］。由于Galectin－3是一種糖化蛋白，需要通過在碳?xì)渥R(shí)別位點(diǎn)與其配體的糖苷結(jié)合后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而發(fā)揮一系列生物學(xué)功能［7］。基質(zhì)金屬蛋白酶家族是一組鋅離子依賴性內(nèi)切酶，與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和腫瘤的新生血管形成密切相關(guān)。MMP－14作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，能夠在細(xì)胞表面活化MMP－2等重要因子。而且有研究顯示MMP－14也與腫瘤的血管新生有密切關(guān)系［6］。膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移與基膜的粘附和細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。MMP－14是膀胱癌細(xì)胞中產(chǎn)生的重要物質(zhì)，作用于周圍的間質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生MMP－14原酶，該酶激活后被腫瘤細(xì)胞攝取到細(xì)胞膜表面。而且激活的MMP－14不僅可以激活MMP－2降解周圍的基質(zhì)，而且自身也可以發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用。而細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是腫瘤生長和擴(kuò)散的屏障，腫瘤細(xì)胞依靠 MMP－14降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)浸潤和轉(zhuǎn)移。CD34是特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，能成功的標(biāo)記腫瘤中的新生血管。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法檢測膀胱尿路上皮癌Galectin－3和 MMP－14的表達(dá)，關(guān)注其與 CD34標(biāo)記的血管密度的關(guān)系，結(jié)果顯示膀胱尿路上皮癌中Galectin－3和 MMP－14高表達(dá)，提示二者在膀胱尿路上皮癌的形成過程中起重要的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示膀胱尿路上皮癌中MVD高表達(dá)，提示腫瘤中存在著血管新生，這為腫瘤的生長及血道播散提供了最便捷的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Galectin－3和MMP－14均與腫瘤體積、浸潤、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Galectin－3和 MMP－14參與腫瘤的浸潤、生長和轉(zhuǎn)移。膀胱尿路上皮癌的生長及轉(zhuǎn)移常常表現(xiàn)出高度的組織特異性，并非隨意性，能轉(zhuǎn)移到特定器官的惡性腫瘤均具有多種機(jī)制促進(jìn)它們侵襲及繁殖。由于膀胱尿路上皮癌中 Galectin－3、MMP－14和MVD之間均呈正相關(guān)性，提示其可能存在著通路的作用，即三種蛋白形成獨(dú)立的作用途徑，其作用機(jī)理可能為Galectin－3作為上游蛋白，促進(jìn) MMP－14的表達(dá)［8，9］，進(jìn)而促進(jìn) MVD的高表達(dá)使新生血管形成，但是其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚需要更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)的生存分析顯示 Galectin－3、MMP－14和MVD高表達(dá)患者的預(yù)后差，因此術(shù)后對(duì)膀胱尿路上皮癌進(jìn)行Galectin－3、MMP－14和CD34的免疫組化檢測，對(duì)判斷膀胱尿路上皮癌的預(yù)后及指導(dǎo)治療有重要價(jià)值。

總之，膀胱尿路上皮癌中 Galectin－3、MMP－14具有協(xié)同作用，參與腫瘤中CD34陽性的血管生成，促進(jìn)腫瘤的生長轉(zhuǎn)移的發(fā)生，術(shù)后聯(lián)合檢測三種蛋白可能與膀胱患者的預(yù)后密切相關(guān)。

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