肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與性別、年齡及臨床分期的關系

齊 紅，劉玉俠，任林廣，徐廣偉，段北野，趙珍誼

（1.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012；2.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春130012）

腫瘤免疫學研究證實，機體功能降低是導致惡性腫瘤發生的主要因素之一，對腫瘤的發生、發展、轉移、療效及預后有直接的影響［1］?？鼓[瘤免疫主要是細胞免疫，T淋巴細胞在腫瘤免疫中起中心調控作用［2］。

流式細胞儀結合現代單克隆抗體技術，可同時對單個細胞上的多種參數進行定量定性分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點。因而，流式細胞術進行淋巴細胞免疫表型分析已逐漸成為腫瘤臨床檢驗的常規工作之一。

關于惡性腫瘤患者免疫功能的變化已有很多報道［3－8］，本文主要探討肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與性別、年齡及臨床分期的關系。對此尚未見相關研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源

患者標本：我們收集了本院自2009年以來住院的肺癌患者外周靜脈血。其中，男44例，女43例，年齡39－80歲，中位年齡59歲。均經病理或細胞學檢查確診證實，。按TNM分期，Ⅰ期23例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期26例。

正常對照組標本：取自長春市中心血站獻血員外周靜脈血，年齡20－40歲，男性62例，女性38例。

1.2 主要儀器及試劑

流式細胞儀及相關熒光標記單克隆抗體均購自美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

采用流式細胞術，通過四色熒光標記進行淋巴細胞亞群的檢測，采用CellQuestPro軟件分析淋巴細胞群體百分含量。實驗步驟簡述如下：加入熒光抗體CD45／／483染液5μl于 A管中，CD3／16＋56染液10μl于B管中，向各管內分別加入相對應的細胞樣品各100μl，充分混勻，20－25℃條件下避光標記15－20min。再向各管內分別加入生理鹽水1 ml，震蕩混勻，避光保存。4h內上機檢測。

1.4 統計學處理

所有數據經SPSS16.0統計軟件處理，結果以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用兩樣本均數t檢驗。

2 結果

肺癌組與正常對照組比較CD3＋、CD3＋CD4＋及CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數明顯下降（P＜0.01），而 CD3＋CD8＋和 CD3＋CD16＋CD56＋細胞兩組間無顯著變化，見表1。

患者的性別不同，淋巴細胞亞群百分數也有不同。表2結果顯示，女性CD3＋CD4＋細胞明顯多于男性（P＜0.01），而CD3－CD16＋CD56＋細胞明顯少于男性（P＜0.01）。

淋巴細胞亞群百分數還與患者的年齡有關。從表3和表4可見，51－60歲年齡段患者CD3＋CD4＋細胞百分數明顯低于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD4＋細胞百分數（P＜0.01），而 CD3＋CD8＋細胞百分數明顯高于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD8＋細胞百分數（P＜0.05）≦50歲年齡段患者CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數明顯少于51－60歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數（P＜0.01）。

肺癌患者的病理分期與其免疫功能狀態更是關系密切。表5和表6數據表明，除了CD3－CD16＋CD56＋細胞以外，其他4個亞群基本上隨著分期愈晚數值愈低。Ⅰ期與Ⅱ期之間差異不明顯。

我們還對CD3＋CD8＋細胞的兩個亞群CD8＋／CD28＋和CD8＋／CD28－進行了比較，發現隨著分期愈晚CD8＋／CD28＋數值愈低而CD8＋／CD28－則恰恰相反（見表7和表8）。

表1 肺癌患者與正常對照組淋巴細胞亞群比較（±s）

表1 肺癌患者與正常對照組淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數值（%）患者（n＝87） 健康（n＝100） P值59.18±8.05 69.98±5.79 0.0000 CD3＋CD4＋ 31.16±5.75 35.25±5.16 0.0000 CD3＋CD8＋ 24.12±4.27 25.08±4.34 0.1856 CD3－CD16＋CD56＋ 13.02±4.21 14.91±4.87 0.0054 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋2.81±0.87 2.73±1.09 0.5836

表2 男女肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表2 男女肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數值（%）男性（n＝44） 女性（n＝43） P值57.94±8.44 60.45±8.69 0.1753 CD3＋CD4＋ 29.16±5.52 33.19±6.12 0.0013 CD3＋CD8＋ 25.03±4.37 23.20±5.07 0.0747 CD3－CD16＋CD56＋ 15.06±3.67 10.83±3.48 0.0000 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋2.48±1.41 2.10±1.09 0.1639

表3 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表3 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數值（%）≦50（n＝13）51－60（n＝35） ≥61（n＝39）58.52±6.25 59.57±7.26 58.65±6.84 CD3＋CD4＋ 33.57±5.08 29.23±4.94 31.88±7.86 CD3＋CD8＋ 21.58±1.62 25.91±5.56 23.40±3.61 CD3－CD16＋CD56＋ 11.15±2.99 13.25±4.51 13.16±4.24 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋3.55±0.97 1.97±1.02 1.63±0.77

表4 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較結果

表5 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表5 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數值（%）Ⅰ（n＝23） Ⅱ（n＝15） Ⅲ（n＝23） Ⅳ（n＝26）CD3＋ 61.79±6.38 62.22±7.35 57.85±6.80 56.02±7.32 CD3＋CD4＋ 33.77±6.36 32.55±4.41 29.59±5.77 30.61±6.22 CD3＋CD8＋ 25.14±5.36 27.44±4.35 24.53±5.58 20.99±3.67 CD3－CD16＋CD56＋ 14.58±2.67 10.83±3.05 11.96±3.76 15.56±3.74 CD3＋CD16＋CD56＋3.71±1.29 3.16±1.44 3.23±0.60 1.55±0.68

表6 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較結果

表7 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數值比較（±s）（n＝10）

表7 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數值比較（±s）（n＝10）

細胞表面標志 CD3＋CD8＋亞群數值（%）ⅠⅡⅢⅣ10.51±2.14 9.30±1.46 8.92±0.66 6.63±1.57 CD8＋／CD28－ 16.59±2.84 17.73±2.50 18.34±4.80 18.72±3.61 CD8＋／CD28＋

表8 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數值比較結果

3 討論

淋巴細胞亞群分析是檢測機體免疫功能的重要指標，它總體反映機體當前的免疫功能、狀態和平衡水平，并可以輔助診斷某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態反應性疾病等），對分析發病機制，觀察療效及評估預后有重要意義。

CD3代表總T細胞，存在于所有成熟T細胞膜表面，是機體最重要的免疫細胞群。在機體的抗腫瘤免疫應答反應中，以T細胞亞群的細胞免疫為主。根據T細胞表面的分化抗原可將成熟T細胞分為CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋兩大亞群，前者為輔助／誘導T細胞，具有調節免疫反應的活性，可以輔助B細胞產生抗體，繼而分泌細胞因子。后者為抑制／殺傷T細胞，具有免疫抑制和細胞毒性作用［9－10］。

有報道表明，以CD16和CD56聯合標記并通過CD3雙色標記用以區分 NK細胞（CD3－CD16＋CD56＋）和 NK樣 T細胞（CD3＋CD16＋CD56＋），方法穩定而實用，具有重要的臨床應用價值［11］。

NK細胞是不同于T、B淋巴細胞，具有直接殺傷靶細胞效應的一類淋巴細胞。NK細胞殺傷效應的靶細胞有腫瘤細胞、病毒或細菌感染的細胞以及機體某些正常細胞，具有抗腫瘤、抗感染、免疫調節等功能，從而行使免疫監視功能，在抑瘤及抗腫瘤轉移方面起重要作用［12］。

通常認為，構成機體免疫系統的淋巴細胞有三種細胞系組成，一是由胸腺產生的T細胞，二是由骨髓分化而來的產生抗體的B細胞，三是自然殺傷細胞（NK細胞）。而新近發現存在第四種淋巴細胞—NKT細胞。它是同時顯示NK細胞和T細胞某些特征的一類免疫細胞，具有細胞毒性和免疫調節作用。

在本研究中，我們檢測了CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3－CD16＋CD56＋和 CD3＋CD16＋CD56＋5種表型，檢測結果以在淋巴細胞中的百分比表示。結果發現，肺癌組 CD3＋、CD3＋CD4＋和CD3－CD16＋CD56＋細胞均顯著低于正常對照組（P＜0.01），CD3＋CD8＋和CD3＋CD16＋CD56＋細胞兩組間無顯著差異。這與相關報道趨勢一致［13］。

患者的性別不同，淋巴細胞亞群百分數也有不同。女性CD3＋CD4＋細胞明顯多于男性（P＜0.01），而CD3－CD16＋CD56＋細胞明顯少于男性（P＜0.01）。

淋巴細胞亞群百分數還與患者的年齡有關。51－60歲年齡段患者CD3＋CD4＋細胞百分數明顯低于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD4＋細胞百分數（P＜0.01），而CD3＋CD8＋細胞百分數明顯高于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD8＋細胞百分數（P＜0.05）；50歲年齡段患者 CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數明顯少于51－60歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數（P＜0.01）。

在正常人群中，有人報道了淋巴細胞亞群存在性別差異和年齡差異，甚至存在地區和民族差異［14］。焦陽等研究發現，國內人群不同年齡組淋巴細胞亞群存在較大差異。青年組（19－44歲）、中年組（45－64歲）、老年組（＞65歲）三組相比B細胞絕對值、T細胞絕對值、CD8＋T細胞絕對值有顯著差異［15］。

郭志宏等研究發現男性和女性的CD3＋百分率和CD3＋CD4＋細胞百分率和絕對數均有差異，表現為女性高于男性。而CD3＋絕對數和CD3＋CD8＋細胞百分數和絕對數沒有性別差異［16］。關于惡性腫瘤患者淋巴細胞亞群是否存在性別差異和年齡差異，未見相關報道。

肺癌患者的病理分期與其免疫功能狀態更是關系密切。我們的結果表明，除了 CD3－CD16＋CD56＋細胞以外，其他4個亞群基本上隨著分期愈晚數值愈低。Ⅰ期與Ⅱ期之間差異不明顯。這與相關報道也是一致的。

CD3＋CD8＋細胞由CD28可以區分出T抑制細胞亞群CD8＋／CD28－和細胞毒T細胞（CTL）亞群CD8＋／CD28＋［17］，二者分別是淋巴細胞中重要的免疫調節細胞和殺傷效應細胞。

本實驗中，我們對CD3＋CD8＋細胞的兩個亞群CD8＋／CD28＋和 CD8＋／CD28－進行了比較，發現隨著分期愈晚CD8＋／CD28＋數值愈低而CD8＋／CD28－則恰恰相反。

綜上所述，我們對肺癌患者與正常對照組人群的淋巴細胞亞群進行了比較分析，發現肺癌患者淋巴細胞亞群多項指標發生明顯變化，表明其免疫功能低下。而且隨著臨床分期愈晚降低愈明顯。同時，我們還對肺癌患者淋巴細胞亞群變化與其性別年齡進行了對比分析，發現有些變化與其性別年齡有關。我們認為檢測肺癌患者外周血淋巴細胞亞群對了解患者免疫功能，病情進展和預后評估都將具有重要的臨床意義，也將為免疫治療提供理論依據。

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