不同抗凝處理對心梗后循環microRNA檢測影響的研究

張 洋，聶 宇，于金星，叢祥鳳，陳 曦＊

（中國醫學科學院·北京協和醫學院 阜外心血管病醫院1.檢驗科；2.心血管轉化醫學國家重點實驗室，北京100037）

心血管疾病是當今世界上威脅人類最嚴重的疾病之一，全球每年約有1700萬人死于心血管疾病，而其中有一半以上死于急性心肌梗死。近年來，我國急性心肌梗死和不穩定性心絞痛發病率明顯上升，每年死于急性心肌梗死的人數超過了100萬［1］。及時準確診斷急性心肌梗死能夠為醫療干預手段提供有效指導，進而最大程度減少該類疾病對患者造成的損害。隨著心臟組織特異microRNA（miRNA）及心血管疾病相關miRNA的發掘，急性心肌梗死循環miRNA標志物的研究已經初見端倪［2］。當前已有研究指出，血漿或血清中miR－1，miR－133，miR－208，miR－499等的含量能夠靈敏、特異反應急性心肌梗死的發生發展，有希望成為診斷心肌梗死的標志物［3－5］。但在以往的實驗中，研究者均從血漿或血清中檢測miRNA，而對于同一種miRNA，血漿和血清里哪種檢測含量更高，尚未有報道進行比較。若將miRNA作為疾病的生物標志物引入臨床，如何處理血標本能夠最大程度保證急性心肌梗死miRNA標志物檢測的準確性，是臨床檢驗工作者首要解決的問題。因此在本研究中，我們計劃比較血漿和血清中循環miRNA的檢出率，以及不同抗凝劑處理（EDTA抗凝、枸櫞酸鈉抗凝）所分離的血漿中循環miRNA的檢出率，并對其診斷指示作用加以評估，以明確利用循環miRNA進行急性心肌梗死診斷中最合適的抗凝劑選擇。

1 對象與方法

1.1 對象 阜外心血管病醫院2010年11月－2011年2月急診胸痛6小時內被確診為AMI患者13例，AMI診斷標準均符合WHO急性心肌梗死診斷標準。其中男11例，女2例，年齡37－82歲，平均年齡（60±14）歲。心電圖均有ST－T改變，梗死部位：前壁3例（包括前壁、前間壁、廣泛前壁），下壁9例（包括下壁、正后壁、右室）。對照組為11例健康體檢者，其中男10例，女1例，年齡48－70歲，平均（57±7）歲，均排除近期或遠期感染、心、肝、腎功能異常，排除心血管病和內分泌疾病史。

1.2 血樣處理及保存 在AMI被確診的第一時間即照常規血液采集的標準操作規程和方法采集AMI患者血樣，分別用分離膠、EDTA抗凝和枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管采集血樣。采集后的血液3 000rpm離心10min，分別分離出血清和血漿，裝于1.5ml無菌Ep管中，－80℃凍存，待統一檢測；對照組血樣亦按照上述方法采集與處理。

1.3 血漿／血清RNA提取 提取血漿／血清總RNA，步驟如下：500μl血漿／血清中加入500μl TRIzol，渦旋混勻，室溫靜置5min；加200μl氯仿，顛倒混勻，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，去除蛋白；13 000rpm 4℃離心15min，將上清移至新的離心管；加0.75體積的異丙醇至上清中，顛倒混勻，室溫靜置10min；13 000rpm 4℃離心10min，沉淀RNA；吸棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌一次；7 500 rpm 4℃離心5min，沉淀RNA；吸凈乙醇，干燥RNA；20μl DEPC 水溶解 RNA（58℃ 水浴 10 min）。

1.4 TaqMan qRT－PCR檢測 microRNA含量 取3μl提取的RNA樣本，利用逆轉錄莖環引物及TaqMan探針進行實時熒光定量PCR（TaqMan qRT－PCR）檢測血漿／血清中 miR－1和 miR－133a的含量，操作步驟見說明書。檢測過程分為2部反應：利用特異莖環引物進行逆轉錄反應，反應體系見表1，反應條件：16℃，30分鐘，42℃，30分鐘，85℃，10分鐘；TaqMan熒光定量PCR反應：反應體系見表2，反應條件：95℃，10分鐘，（95℃，15秒，62℃，1分鐘）45個循環。

1.5 標準曲線制備 委托上海吉瑪公司合成miR－1和miR－133a的模擬物（mimics）作為標準品，溶解為20μM的miRNA mimics溶液，再梯度稀釋為（10－3，10－4，10－5，10－6，10－7）μM 作為模板，進行TaqMan qRT－PCR檢測，繪制標準曲線。根據標準曲線所繪公式，計算各樣本中miRNA的含量。

1.6 其他實驗室檢測 SYSMEX－1800i全血細胞分析儀檢測WBC，日立7180全自動生化分析儀檢測CK－MB。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件包進行統計學處理，計數資料用例數或百分數表示，計量資料用±s表示，兩組比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。繪制ROC曲線，以曲線下面積AUC來評價最佳抗凝劑的選擇。

表1 miRNA－莖環引物逆轉錄15μl反應體系

表2 miRNA TaqMan qPCR 20μl反應體系

2 結果

2.1 病歷資料 如表3所示，入選AMI患者和正常人年齡及性別相匹配，其中AMI患者心電圖均有ST－T改變，WBC及CK－MB均高于正常人。

表3 入選AMI患者和正常人各項指標

2.2 標準曲線的線性范圍 TaqMan qRT－PCR擴增梯度稀釋的 miR－1和 miR－133amimics，成功繪制標準曲線，獲得相關性公式，見表3。

表3 miRNAs擴增標準曲線公式

2.3 正常人群血漿／血清miRNA的檢測 提取11名正常人不同抗凝處理血漿和血清中的RNA，利用TaqMan qRT－PCR 檢 測 miR－1 和 miR－133a的 含量。結果顯示，在健康人群中能夠有效檢測到miR－1和 miR－133a（表4）。

表4 正常人血漿／血清中miRNAs的含量

2.4 AMI患者血漿／血清miRNA的檢測

提取13名AMI患者不同抗凝處理血漿和血清中的RNA，利用TaqMan qRT－PCR檢測 miR－1和miR－133a的含量。結果表明，在AMI患者的血漿／血清中能夠有效檢測到miR－1和miR－133a（表5）。

2.5 采血后不同抗凝處理對檢測結果的影響

根據檢測結果，表3所示公式，計算miRNA含量，獲得患者血漿／血清中的miR－1和miR－133a表達水平，繪制ROC曲線，比較采血后不同抗凝處理對檢測結果的影響（圖1）。相比較而言，血清和EDTA抗凝血漿檢測miR－1和miR－133a的AUC均高于枸櫞酸鈉抗凝的血漿，提示血清和EDTA抗凝血漿檢測這兩種miRNA具有更好的敏感性和特異性，而EDTA抗凝血漿為檢測這兩種miRNA的最理想樣本（表6）；miR－1的 AUC高于 miR－133a，提示miR－1在診斷心梗方面具有更好的特異性和靈敏性。

表5 AMI患者血漿／血清中miRNAs的含量

表6 miR－1和 miR－133a的 AUC

圖1 不同抗凝處理對miR－1和miR－133a檢測水平及特異性和敏感性的影響

3 討論

自1954年發現血清門冬氨酸氨基轉移酶（AST）活性在急性心梗病人血清中升高以來，心臟生物標志物作為有效的臨床診斷標準之一，因其檢測過程的便捷、無創、高效等優勢，一直為醫療工作者和研究人員所青睞。目前，心肌肌鈣蛋白（cnTs）、肌酸激酶同工酶（CK－MBs），肌紅蛋白（MB）等心肌損傷標志物已被廣泛應用于急性心肌梗死的臨床診斷［6，7］。近年來，隨著miRNA在心臟發育及心血管疾病發生發展中功能的逐步闡明，加之miRNA檢測手段的不斷成熟［8－10］，人們開始將目光轉向了急性心肌梗死循環miRNA（circulating miRNA）標志物的開發。

miRNA是一類內源性的單鏈非編碼RNA，一般由18－25個核苷酸組成。作為微型調節分子，miRNA通過與60%以上編碼蛋白質的信使RNA（mRNA）3’－UTR特異性結合，抑制蛋白質翻譯或直接導致mRNA降解，在轉錄后水平調控蛋白質的表達，進而在生命活動過程中發揮重要作用［11］。針對不同組織和疾病中的miRNA表達譜分析發現，miRNA的表達存在明顯的組織特異性，并在一些疾病的發生發展過程中miRNA的表達譜會發生顯著變化。目前已有研究指出，血漿或血清中miR－1，miR－133，miR－208，miR－499等的含量能夠靈敏、特異反應急性心肌梗死的發生發展。但若將miRNA作為標志物引入臨床，如何處理血標本，對于同一種miRNA，血漿和血清里哪種檢測含量更高，則是首要解決的問題之一。本實驗在心梗患者及正常人血清和血漿中檢測了miR－1和miR－133a，結果顯示：miR－1，miR－133a可在心梗患者血清及血漿中有效檢測到，但在不同抗凝劑處理的標本中表達有差異，采血后經分離膠及EDTA抗凝處理的標本miR－1，miR－133a的表達量高于經枸櫞酸鈉抗凝處理的標本。在正常對照組：miR－1，miR－133a表達含量較低，但同樣是采血后經分離膠及EDTA抗凝處理的標本miR－1，miR－133a的表達量高于經枸櫞酸鈉抗凝處理的標本。

為進一步確定采血后不同抗凝處理對檢測結果敏感性和特異性的影響，我們根據檢測結果，繪制了miR－1，miR－133a的 ROC 曲線，結果顯示血清和EDTA抗凝血漿標本檢測miR－1和miR－133a的曲線下面積AUC均高于枸櫞酸鈉抗凝的血漿，而EDTA抗凝血漿標本檢測miR－1和miR－133a的曲線下面積最大，提示經EDTA抗凝處理的血漿為檢測這兩種miRNA最佳的樣本選擇；同時miR－1的曲線下面積AUC高于miR－133a，提示miR－1在診斷心梗方面具有更好的特異性和靈敏性。

本研究對采血后不同抗凝處理的心梗后循環microRNA檢測結果進行了比較。明確了EDTA抗凝為循環miRNA進行急性心肌梗死診斷的最合適的抗凝劑選擇。

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