RA患者外周血DcR3表達水平與疾病活動性相關分析

孫可歆，趙 臣＊，李 艷，李春輝，郭素紅，張 磊

（1.吉林醫藥學院 檢驗系，吉林 吉林132013；2.北華大學附屬醫院 檢驗科）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的自身免疫性疾病，以慢性、多關節滑膜炎和關節外病變為主要臨床表現。研究表明［1］，Th1細胞分泌的細胞因子γ干擾素（interferon gamma，IFN－γ）和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）是引起滑膜炎癥的主要致病因素；而Weyand等［2］基于患者的研究發現RA患者體內高表達 Th1型細胞因子IFN－γ、TNF－α和IL－10，不表達 Th2型細胞因子IL－2和IL－4。Yudoh等［3］認為，正是Th1／Th2細胞亞群的不平衡在RA的發病機制中有著關鍵的作用。

誘騙受體3（decoy receptor 3，DcR3）是近年來新發現的腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的新成員。DcR3是一種細胞表面受體，能和腫瘤壞死因子超家族成員FasL、LIGHT以及TL1A相結合，對細胞凋亡起負調控的作用［4］，或通過影響樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的分化和成熟，調節 Th1／Th2細胞亞群的平衡，從而調節IFN－γ等Th1型細胞因子和IL－4等Th2型細胞因子的水平，在腫瘤免疫、自身免疫中發揮著重要的作用［5，6］。DcR3mRNA在某些自身免疫病如系統性紅斑狼瘡（SLE）、矽肺患者的外周血單核細胞（PBMC）中DcR3基因呈高度表達［7，8］。

本研究采用ELISA方法和實時熒光定量PCR（FQ－PCR）法對RA患者血清中DcR3濃度與PBMC中DcR3mRNA表達水平進行了檢測和比較，結合外周血IFN－γ／IL－4表達水平的變化，探討DcR3在RA免疫紊亂過程中所起的作用，為進一步闡明RA的免疫病理機制提供更多的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 資料

臨床資料及標本收集2011年4月至2011年6月住院和門診RA患者39例，男性9例，女性30例，平均年齡（40.38±12.56）歲。所有RA 病例均符合1987年美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）修訂的 RA分類標準［9］；以28個關節疾病活動度評分（DAS28）為疾病活動度評分標準，39例患者中活動期25例，緩解期14例。健康體檢人員26例，男性9例，女性17例，平均年齡（42.56±10.48）歲。各組人員均排除其它自身免疫性疾病和嚴重心肺功能異常者。經統計學檢驗各組年齡、性別無顯著性差異（P＞0.05）。

［注：DAS28評分參照PREVOO的計算方法：DAS28＝0.56sqrt（T28）＋0.28×sqrt（SW28）＋0.7×ln（ESR）×1.08＋0.16。DAS28以28個關節計分：包括雙肩、雙肘、雙腕、雙手掌指關節、雙手近端指間關節、雙膝關節。DAS28＞5.1表示疾病活動高：3.2＜DAS28≤5.1表示疾病中度活動，2.6＜DAS28≤3.2表示疾病活動性低，DAS28≤2.6表示疾病緩解］

1.2 主要儀器和試劑

低溫離心機（索福Biofuge Stratos），普通PCR（北京博大泰恒生物技術公司），熒光定量PCR7300（美國ABI公司）；人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制劑公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），逆轉錄試劑（Fermentas），引物燃料探針（北京天一輝遠），熒光定量MIX（美國ABI）Human DcR3ELISA試劑盒（奧地利Bender MedSystems公司），人IFN－γ ELISA試劑盒和人IL－4ELISA試劑盒（武漢博士德公司），全自動酶標儀（芬蘭雷勃公司）。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分離 取肘靜脈血3ml，肝素抗凝，PBS以1∶1稀釋，混勻，沿管壁輕緩移入放有等體積Ficoll－泛影葡胺（人淋巴細胞分離液）離心管，1500r／min，15min，離心半徑10cm，吸取分層液的云霧層，PBS洗滌，計數以1×106個細胞／ml加1 ml Trizol，置－70℃冰箱凍存。

1.3.2 RNA抽提 采用Trizol試劑、異硫青酸胍－酚－氯仿提取總RNA。紫外分光光度計檢測并計算RNA濃度（濃度μg／ml＝A260×40× 稀釋倍數）和A260／A280比值。

1.3.3 cDNA的合成20μl逆轉錄反應體系，嚴格按照說明書操作，反應條件為25℃10min，55℃30 min，85℃5min。

1.3.4 實時熒光PCR定量PCR（FQ－PCR）檢測外周血PBMC中DcR3mRNA表達水平。

1.3.4.1 20μl反應體系：10μl熒光定量 Mix，2μl cDNA，上、下游引物各1μl，6μl水。

1.3.4.2 引物序列：β－actin上游引物5’－ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGA －3’，下游引物 5’－GCGAAGCCGGCCTTGCACAT－3’，120bp；DcR3上游引物 5’－TCAATGTGCCAGGCTCTTC －3’，下游引物5’－GCCTCTTGATGGAGATGTCC－3’，144bp。

1.3.4.3 反應條件：50℃2min，95℃10min，（95℃15秒，60℃1min收集熒光）40循環，延續95℃15秒，60℃1min，95℃15秒，60℃15秒。用美國 ABI公司熒光定量PCR7300檢測DcRmRNA表達水平，以DcR3與內參β－actin比值作為DcR3mRNA的相對表達量。

1.3.5 血清的分離 新鮮靜脈血3ml，1 500rpm離心10min，分離血清，－20℃凍存。

1.3.6 血 清 DcR3、IL－4 和IFN－γ測定血清DcR3、IL－4和IFN－γ檢測采用ELISA法，操作嚴格按說明書進行。

1.3.7 統計學分析 所有統計學處理均采用SPSS13.0統計軟件分析，P＜0.05表示差別具有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血PBMCs中DcR3mRNA表達水平

以熒光定量PCR檢測外周血PBMC中DcR3mRNA與內參β－actin的表達水平，以二者比值作為DcR3mRNA的相對表達量。結果表明，活動期RA患者DcR3mRNA水平高于緩解期RA患者和健康對照組，差異有顯著性（P＜0.01）；緩解期DcR3mRNA水平與正常人差異無顯著（P＞0.05），見表1。

表1 PBMCs中DcR3mRNA表達相對量（±s）

表1 PBMCs中DcR3mRNA表達相對量（±s）

注：a：P ＜0.01（與健康對照組比較）；b：P ＜0.01（與緩解期RA患者比較）

DCR3mRNA RA 活動期 25 0.67±0.33 n ab 26 0.17±0.18 RA 緩解期 14 0.21±0.14健康對照組

2.2 血清DcR3、IFN－γ和IL－4水平檢測結果

采用ELISA方法檢測血清中DcR3、IFN－γ和IL－4水平。結果表明，活動期RA患者血清DcR3和IFN－γ水平顯著高于健康對照組和緩解期RA患者（P均＜0.01），健康對照組和RA緩解組無明顯差異（P＞0.05）；IL－4水平各組無明顯差異；IFN－γ／IL－4比值顯示，活動期RA患者顯著高于健康對照組和緩解期RA患者（P均＜0.01），正常對照組和RA緩解組無明顯差異（P＞0.05），見表2。

2.3 RA患者外周血 DcR3mRNA、血清DcR3、IFN－γ／IL－4與DAS28評分的相關性分析

經Pearson相關性分析，RA患者外周血DcR3 mRNA水平和血清IFN－γ／IL－4比值與 DAS28 評分呈顯著正相關趨勢（r＝0.517，P＝0.000；r＝0.388，P＝0.001），血清 DcR3水平與 DAS28評分無相關趨勢（P＞0.05），見表3。

表2 RA患者血清DcR3、IFN－γ、IL－4及IFN－γ／IL－4水平的比較（±s）

表2 RA患者血清DcR3、IFN－γ、IL－4及IFN－γ／IL－4水平的比較（±s）

注：a：P ＜0.01（與健康對照組比較）；b：P＜0.01（與緩解期RA患者比較）

IL－4 RA 活動期 25 1461.43±721.63ab 106.37±26.22ab 15.56±7.41 7.03±3.16 n DcR3（pg／ml） IFN－γ（pg／ml） IL－4（pg／ml） IFN－γ／ab RA 緩解期 14 902.38±487.59 32.02±17.15 13.14±6.82 2.68±2.27健康對照組 26 773.16±316.04 28.42±16.58 11.76±8.34 2.17±1.51

表3 RA患者外周血 DcR3mRNA、血清 DcR3、IFN－γ／IL－4水平與DAS28scores相關性分析（±s）

表3 RA患者外周血 DcR3mRNA、血清 DcR3、IFN－γ／IL－4水平與DAS28scores相關性分析（±s）

DAS28 scores DcR3mRNA DcR3IFN－γ／IL－4 r P RA患者r P r P 0.517 0.000 0.073 0.067 0.388 0.001

3 討論

RA是一種慢性、炎性、系統性的自身免疫性疾病。Bamias等［10，11］報道RA患者血清DcR3的濃度顯著高于健康對照組。他們發現RA患者血清和關節腔積液中的DcR3濃度要明顯高于骨性關節炎和健康對照組，表明DcR3在RA的發病機制中起到了重要作用。本研究中，活動期RA患者外周血DcR3 mRNA表達水平和血清DcR3濃度顯著高于緩解期RA患者和健康對照組，與Bamias等研究相符。

正常人的體內Th1／Th2型細胞因子處于平衡狀態，而RA患者的促炎性Th1細胞及其分泌的IFN－γ和抗炎性Th2細胞及其分泌的IL－4的失衡，在RA的發病機制中具有重要的作用［12］。RA患者體內，促炎性細胞因子因子IFN－γ、TNF－α、IL－2大量存在，提示炎癥關節局部存在Th1極化；另一方面，機體的抗炎機制如IL－4、IL－6、IL－10雖然也增高，但不足以完全控制炎癥的進展，IFN－γ／IL－4比值增高，最終導致炎癥的加重和持續存在［13］。本研究發現，活動期RA患者血清IFN－γ水平及IFN－γ／IL－4比值均明顯高于緩解期RA患者和健康對照組，提示RA患者體內存在明顯的Th1／Th2失衡現象，與Herman等［13］研究相符。由于DcR3可抑制FasL、LIGHT及TL1A的作用，誘導以IFN－γ為代表的Th1型細胞因子的分泌［14］，并通過影響DCs的分化和成熟，來調節IFN－γ及IL－4等細胞因子［6］，調節Th1／Th2平衡。因此我們認為，正是由于活動期RA患者過表達DcR3，導致IFN－γ／IL－4水平發生偏斜，引起Th1／Th2失衡，最終導致關節滑膜的炎癥發生。

相關分析表明，RA患者DcR3mRNA表達水平及IFN－γ／IL－4比值與DAS28評分呈正相關，提示RA患者體內DcR3水平的升高有利于細胞因子分泌模式向Th1方向傾斜，再次說明DcR3在RA的發病過程中可能起著重要的作用。但本研究中RA患者血清中DcR3高度表達，與疾病的活動性無關，與Shinya Hayash等［15］研究相符。

總之，本研究結果的意義是在國內首先研究了DcR3在RA發病中的作用，為進一步揭示RA的發病發展的機制提供了有價值的線索，同時為RA的診斷及治療提供有價值的線索。

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