絞股藍總皂苷納米乳的制備及其抗衰老作用研究

申進寶，孫紅武

（1.西安醫學高等?？茖W校，西安710065；2.第三軍醫大學藥學院，重慶400038）

絞股藍總皂苷納米乳的制備及其抗衰老作用研究

申進寶1＊，孫紅武2

（1.西安醫學高等?？茖W校，西安710065；2.第三軍醫大學藥學院，重慶400038）

目的：研究絞股藍總皂苷納米乳的制備及其抗衰老作用。方法：通過對絞股藍總皂苷溶解度試驗和偽三元相圖確定其最佳處方并制備出絞股藍總皂苷納米乳，用透射電鏡和粒度分析儀分析其形態和對粒徑進行鑒定。以皮下注射D-半乳糖復制亞急性衰老大鼠模型。30只SD大鼠均分為6組，即正常對照（2 mL生理鹽水）、亞急性衰老模型（2 mL生理鹽水）、絞股藍水溶液（120 mg·kg－1）和絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量（180、120、60 mg·kg－1）組；25只老年大鼠均分為5組，即自然衰老模型（2 mL生理鹽水）、絞股藍水溶液（120 mg·kg－1）和絞股藍納米乳高、中、低劑量（180、120、60 mg·kg－1）組。灌胃給藥，每天1次，連續30 d。檢測大鼠血清、下丘腦和心臟的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮（NO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）水平。結果：絞股藍總皂苷納米乳最佳處方為聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）/肉豆蔻酸異丙酮（IPM）/丙二醇/水，表面活性劑和助活性劑比例為3∶1，平均粒徑為35.8 nm。與亞急性衰老模型和自然衰老模型組比較，絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量組大鼠血清、心臟和下丘腦組織中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05），而NO、MDA含量顯著減少（P＜0.05）。結論：絞股藍總皂苷納米乳有較好的抗衰老作用，且呈劑量依賴關系。

絞股藍總皂苷；納米乳；抗衰老；D-半乳糖；亞急性衰老模型；自然衰老模型；大鼠；偽三元相圖

絞股藍 Gynostemmapenta phyllum（Thunb）Makino，又名七葉膽、五葉參、七葉參，是葫蘆科絞股藍屬植物，為多年生蔓生草本[1]?，F代藥理學證明絞股藍具有廣泛的藥理作用，能有效地保護心、腦、血管和肝臟，降低血脂、膽固醇含量，抗誘變、抑制腫瘤、防止衰老、增強免疫力、鎮靜止痛等[2，3]。絞股藍總皂苷（Gypenosides，Gyp）是從中藥絞股藍中提取出的有效成分群，由80余種具有人參皂苷基本結構的單體皂苷組成，具有降血脂、抗氧化等多種作用[4]，其上市系列產品劑型主要有茶、片劑、丸劑、粉劑、注射劑和軟膏劑等[1]。絞股藍總苷片臨床用于防治動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，As），還可應用于降血脂和減肥[5]。但是絞股藍總皂苷化學成分不穩定，容易氧化，大大制約了其臨床應用。納米乳是由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例形成的一種透明、低黏度且熱力學穩定的分散體系。近年來研究表明，納米乳對易氧化、水解的藥物能起到很好的保護作用，可提高藥效和生物利用度[6]。本研究在成功制備絞股藍總皂苷納米乳基礎上，重點對自然衰老和亞急性衰老模型大鼠的抗衰老作用進行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EB-280型電子天平（日本Shimadzu公司）；JME-1230型透射電鏡（日本Jeol公司）；Nicomp388/Zeta PALS型激光粒度測定儀（英國Malvern Instrument公司）；KQ50B型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Lab6 000型全自動生化分析儀（日本日立公司）；SP-756P型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試藥

絞股藍總皂苷（陜西康威生物工程有限公司，批號：20060324）；Tween 80、Span 80、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，北京鳳禮精求商貿有限責任公司，批號：20060721）；橄欖油（批號：20060313）、肉豆蔻酸異丙酮（IPM，批號：20060421）、杏仁油（批號：20050625）均購自西安嘉里油脂工業有限公司；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20060503）、過氧化氫酶（CAT，批號：20060916）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號：20061108）、丙二醛（MDA，批號：20060713）、一氧化氮（NO，批號：20060921）、總抗氧化能力（T-AOC，批號：20061007）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；D-半乳糖（上海工碩生物技術有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD老年大鼠25只，18月齡，♀，體重（350±10）g；SD青年大鼠30只，2月齡，♀，體重（220±10）g，均由第四軍醫大學實驗動物中心提供（動物使用許可證號：醫動證字SCXK（軍）2006002）。

2 方法與結果

2.1 絞股藍總皂苷納米乳的溶解度確定

選擇RH40、Tween80、Span80 3種表面活性劑，橄欖油、IPM、杏仁油3種油相和甘油、丙二醇、1，3-丁二醇3種助表面活性劑。取上述表面活性劑、油相、助表面活性劑適量，分別置具塞錐形瓶中，加入過量的絞股藍總皂苷，室溫震搖，過夜，用紫外分光光度計檢測其溶解度。結果表明，絞股藍總皂苷在3種表面活性劑中的溶解度依次為：RH40＞Tween80＞Span80，最終選擇RH40為表面活性劑；在油中的溶解度依次為：IPM＞橄欖油＞杏仁油；在助表面活性劑中的溶解度依次為：1，3-丁二醇＞丙二醇＞甘油。

2.2 納米乳的制備

納米乳的制備方法采用轉相乳化法，即將表面活性劑和助表面活性劑加入油相中，攪拌均勻，然后向混合體系中緩慢滴加水相（去離子水），邊加邊攪拌。開始時，體系為黏度較小的澄清油相，加入去離子水后體系變混濁，經過攪拌，體系會恢復澄清狀態，則為油包水型（W/O）納米乳；當去離子水加到臨界點時，體系會突然變得很黏稠很透亮，同時攪拌困難，此時為液晶相或凝膠相；繼續滴加去離子水并不斷攪拌，當水加到一定量時，體系會突然變稀，則形成水包油（O/W）型納米乳。

2.3 絞股藍總皂苷納米乳處方的篩選及其偽三元相圖的繪制

將表面活性劑按表面活性劑與助表面活性劑的重量比（Km）為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1混合均勻，制成混合表面活性劑。再將表面活性劑與油相，按重量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9精密稱取定量的混合表面活性劑和油，置于平底玻璃燒杯中混合均勻，在室溫條件下，用恒溫磁力攪拌器攪拌，邊攪拌邊滴加去離子水，直至形成外觀澄清透明的納米乳。以表面活性劑和助表面活性劑、油相和去離子水作為等邊三角形的3個頂點，制備偽三元相圖，相圖每條邊上的點分別表示相應2組分之間的比例關系，相圖任意一點表示相應體系中各組分的質量百分含量。根據油、水、混合表面活性劑在臨界點的重量分數，制備偽三元相圖，確定納米乳區[7]。根據形成納米乳區和溶解度試驗結果，從而確定其最佳比例。不同比例納米乳的偽三元相圖見圖1。

圖1 不同比例納米乳的偽三元相圖A.Km＝2∶1；B.Km＝3∶1；C.Km＝4∶1；D.Km＝5∶1Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of different proportionsof nanoemulsionA.Km＝2∶1；B.Km＝3∶1；C.Km＝4∶1；D.Km＝5∶1

由圖1可知，當表面活性劑為RH40，1，3-丁二醇為助表面活性劑，IPM為油相，當Km為3∶1時，納米乳區面積最大。根據形成納米乳區越大，載藥量高，形成的納米乳制劑越穩定，確定出絞股藍總皂苷納米乳的最佳處方。

2.4 絞股藍總皂苷納米乳的制備

根據上述確定最佳比例，按比例準確稱取表面活性劑、助表面活性劑和油相，加入小燒杯中混勻，再加入適量絞股藍總皂苷，攪拌均勻后緩慢滴加蒸餾水并攪拌直至形成透明納米乳。研究確定以RH40/IPM/丙二醇/水為處方，其中以Km＝3∶1為最佳處方。稱取處方量的絞股藍總皂苷、表面活性劑、助表面活性劑和油混合均勻，滴加蒸餾水，攪拌即得透明納米乳。

2.5 絞股藍總皂苷納米乳的外觀和粒度分析

取少量絞股藍總皂苷納米乳滴于覆有支持膜的銅網上，靜止10 min后，再滴加入質量分數為3%的磷鎢酸溶液于銅網上負染5 min，自然揮干，透射電鏡觀察納米乳外觀[8]。將絞股藍總皂苷納米乳以去離子水稀釋后，用激光粒度測定儀測定絞股藍總皂苷納米乳的粒徑。用透射電鏡觀察絞股藍總皂苷納米乳的外觀。絞股藍總皂苷納米乳透射電鏡圖見圖2；絞股藍總皂苷納米乳粒度分布見圖3。

由圖2可知，絞股藍總皂苷納米乳的乳滴為球形，大小在1～100 nm之間。由圖3可知，其平均粒徑為35.8 nm，多聚分散指數為0.406，分布范圍窄，大多介于40～60 nm，小于60 nm的粒子占75%；小于80 nm的粒子占90%，粒徑比較均勻。

圖2 絞股藍總皂苷納米乳透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron microscope of gynostemma nanoemulsion

圖3 絞股藍總皂苷納米乳粒度分布圖Fig 3 Particle size distribution of Fiveleaf Gynostemma nanoemulsion

2.6 對亞急性衰老大鼠模型的抗衰老作用

參照文獻[2]制備亞急性衰老大鼠模型和設定藥物濃度。取SD青年大鼠30只，隨機均分為6組，即正常對照（2 mL生理鹽水）、亞急性衰老模型（2 mL生理鹽水）、絞股藍水溶液（120 mg·kg－1）和絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量（180、120、60 mg·kg－1）組。除正常對照組外，其余各組大鼠每天頸背部sc 0.1 mL D-半乳糖（125 mg·kg－1）[6]。ig給藥，每天1次，連續30 d。末次給藥24 h眼球采血，剖檢取心臟、下丘腦快速勻漿，制成心臟、下丘腦組織勻漿液，用于各指標檢測。SOD、CAT、GSH-PX、MDA、NO和T-AOC檢測指標按照試劑盒說明書操作。測定每項指標的吸光度（A）值，并根據試劑盒說明書提供的公式計算所需數據。在實驗過程中，所有大鼠均自由采食和飲水。所有數據均通過SAS 9.0軟件進行處理，各組參數以x±s表示。組間差異按方差分析進行顯著性檢驗，并用最小顯著差法（LSD法）作兩兩比較。絞股藍總皂苷納米乳對亞急性衰老模型大鼠生化指標的影響見表1～表3。

由表1～表3可知，與正常對照組比較，亞急性衰老模型組大鼠血清、下丘腦和心臟中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平顯著下降（P＜0.05），NO和MDA含量顯著增加（P＜0.05）。與亞急性衰老模型組比較，絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量組大鼠血清、心臟和下丘腦組織中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05），NO和MDA含量顯著減少（P＜0.05）。

表1 絞股藍總皂苷納米乳對亞急性衰老模型大鼠血清生化指標的影響（x±s，n＝5）Tab 1 Theeffect of gypenosides nanoemulsion on serum biochemical indexesin subacuteaging rat（x±s，n＝5）

表2 絞股藍總皂苷納米乳對亞急性衰老模型大鼠下丘腦生化指標的影響（x±s，n＝5）Tab 2 The effect of gypenosides nanoemulsion on hypothalamus biochemical indexes in subacute aging rat（x±s，n＝5）

表3 絞股藍總皂苷納米乳對亞急性衰老模型大鼠心臟生化指標的影響（x±s，n＝5）Tab 3 Theeffect of gypenosidesnanoemulsion on heart biochemical indexesin subacuteaging rat（x±s，n＝5）

2.7 對自然衰老大鼠的抗衰老作用

取SD老年大鼠25只，隨機均分為5組，即自然衰老模型（2 mL生理鹽水）、絞股藍水溶液（180 mg·kg－1）和絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量（180、120、60 mg·kg－1）組。ig給藥，每天1次，連續30 d。末次給藥24 h后眼球采血，剖檢取心臟、下丘腦快速勻漿，制成心臟、下丘腦組織勻漿液，用于各指標檢測。實驗指標檢測、數據處理同“2.6”項下方法。絞股藍總皂苷納米乳對自然衰老模型大鼠生化指標的影響見表4～表6。

表4 絞股藍總皂苷納米乳對自然衰老模型大鼠血清生化指標的影響Tab 4 The effect of gypenosides nanoemulsion on serum biochemical indexes in aged rats

表5 絞股藍總皂苷納米乳對自然衰老模型大鼠下丘腦生化指標的影響Tab 5 Theeffect of gypenosidesnanoemulsion on hypothalamusbiochemical indexesin aged rats

表6 絞股藍總皂苷納米乳對自然衰老模型大鼠心臟生化指標的影響Tab 6 The effect of gypenosides nanoemulsion on heart biochemical indexes in aged rats

由表4～表6可知，與自然衰老模型組比較，絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量組大鼠血清、心臟和下丘腦組織中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05），NO和MDA含量顯著減少（P＜0.05）。

3 討論

絞股藍具有廣泛的藥理作用，其在抗衰老、抗疲勞、抗輻射和消除自由基的同時，還能改善神經系統功能、抗潰瘍、抑制膽結石形成和調節內分泌活動[1，9]。有研究證實，絞股藍抗衰老作用主要是由于具有抗氧化成分絞股藍總皂苷。目前，絞股藍的開發還處于比較低的階段，產品有絞股藍茶、絞股藍膠囊等，且還不能較好地克服其穩定性不好和藥效低的問題[8]。由于納米乳是各相同性的透明液體，有多項優點：熱力學穩定，可濾過滅菌，可提高藥物的穩定性，易于保存；通過內核的油相和表面活性劑烴鏈兩部分的增溶可提高藥物的溶解度；可自發形成，易于制備；表面張力低，易通過胃腸壁的水化層，使藥物能直接與胃腸上皮細胞接觸；粒徑小且均勻，藥物的分散性好，可增加膜的通透性，從而促進藥物的吸收，可提高藥物的生物利用度；在一定程度上能保護藥物在胃腸道內免遭酶解，避免肝、胃腸的首關效應，提高藥效等[9]，因此本研究制備出絞股藍總皂苷納米乳有重要意義。同時，納米乳是一個由油、水、表面活性劑、助表面活性劑4個組分組成的、粒徑為1～100 nm、液滴多為球形，大小比較均勻，透明或半透明、具熱力學穩定、不分層的膠體分散系統。因此，納米乳的4個主要組成尤其重要。本研究通過對絞股藍總皂苷在表面活性劑、油、表面活性劑中的溶解度確定了其最佳處方成分，并通過偽三元相圖確定其處方比例，用透射電鏡和粒度分析儀分析其形態和粒徑，充分證實已成功制備出質量穩定、合格的絞股藍總皂苷納米乳。

現研究證實，絞股藍對自然衰老[1]和亞急性衰老模型大鼠[2]有明顯的抗衰老作用。絞股藍抗衰老作用主要是通過抗氧化完成的，同時機體防護氧化作用主要通過3條途徑進行：（1）消除自由基和活性氧以免引發脂質過氧化；（2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（3）除去起催化作用的金屬離子[2]，SOD是機體內重要抗氧化酶之一，其活力和含量反映了機體清除氧自由基的能力，是唯一能特異性清除氧自由基的酶，具有防止自由基生成和蓄積保護細胞膜免受其毒害的作用[9]。大量的研究表明，隨著年齡的增長，SOD逐漸減少，導致體內自由基濃度增加，過氧化反應加強，破壞組織細胞，使組織功能下降，最終引起機體衰老或死亡，是衰老的重要指標之一。SOD具有清除超氧陰離子自由基（O2－），抗衰老、抗輻射、抗炎、抗自身免疫性疾病等作用，其活性的高低間接反映了組織抗氧化能力[10]。過氧化脂質的分解產物之一MDA，能使膜交聯和聚集，并最終導致DNA的交聯，引起突變。因此，MDA可以間接反映體內自由基產生和老化程度，是延緩衰老的重要途徑，MDA也常作為評價衰老的重要指標。NO是20世紀80年代后期發現的一種生物體內重要的信使分子和效應分子，過量的NO可抑制多種與線粒體電子傳遞系統及檸檬酸循環有關的酶，最終引起自由基產生增多，加重氧化應激反應。CAT雖不能直接清除·OH，但其可以降低·OH的前體過氧化氫的濃度，從而起到延緩衰老的作用。GSH-Px能特異性的催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能完整性的作用。研究也證實GSH-Px隨增齡而活性降低，是機體衰老的生化指標之一。T-AOC代表體內酶性和非酶性抗氧化物的總體水平，各抗氧化物之間有相互聯系、協同保護作用，所以T-AOC的測定尤為重要，是反映機體抗氧化能力的重要指標[11]。因此，本研究對MDA、SOD、CAT、NO、GSH-Px、T-AOC等指標進行檢測。下丘腦又稱丘腦下部，位于大腦腹面、丘腦的下方，是調節內臟活動和內分泌活動的較高級神經中樞所在；在衰老過程中，下丘腦出現的一系列結構和功能的改變是導致機體神經內分泌系統紊亂的主要原因和在衰老發展中起重要作用。心臟和下丘腦是人體的重要器官，在生命活動中起著主導作用，調節和支配著機體的大多數生理活動。在抗衰老研究中，心臟和下丘腦是常用的器官。血液能最直接反映出機體的衰老生理狀態。因此，對血清、下丘腦、心臟3個組織中的生化指標進行檢測從而判斷其衰老情況。

D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型是較常用的致衰老模型，該法具有復制方法簡單、耗時短等優點，目前已廣泛應用于研究衰老表現機制以及延緩衰老藥物的篩選[2，12]。亞急性衰老模型組大鼠血清、下丘腦和心臟中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平比正常對照組顯著下降（P＜0.05），而NO和MDA含量顯著增加（P＜0.05），這些變化提示本研究中亞急性衰老模型復制成功。本研究結果表明，絞股藍總皂苷納米乳高、中、低劑量組大鼠血清、心臟和下丘腦組織中的SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px水平比亞急性衰老模型和自然衰老模型組大鼠均顯著升高（P＜0.05），而NO和MDA的含量顯著減少（P＜0.05），證實絞股藍總皂苷納米乳有效好的抗氧化作用，且呈劑量依賴性。

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Preparation and Anti-aging Effects of Gypenosides Nanoemulsion

SHEN Jin-bao
（Xi’an Medical Junior College，Xi’an 710065，China）
SUN Hong-wu
（School of Pharmacy，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To study preparation and anti-aging effects of gypenosides nanoemulsion.METHODS：The optimal prescription was determined by solubility test and pseudo-ternary phase diagram of gypenosides nanoemulsion，and then gypenosides nanoemulsion was prepared.The morphology and particle size of nanoemulsion were analyzed by transmission electron microscope and particle size analyzer.The subacute aging rat model was induced by D-galactose.The rats were divided into 6 groups，such as normal control group（2 mL physiological saline），subacute aging model group（2 mL physiological saline），gynostemmapenta phylum solution group（120 mg·kg－1）and gypenosides nanoemulsion high-dose，middle-dose and low-dose groups（180，120，60 mg·kg－1）.Twenty-five aged rats were divided into 5 groups，such as aged model group，gynostemmapenta phylum solution group（120 mg·kg－1）and gypenosides nanoemulsion high-dose，middle-dose and low-dose groups（180，120，60 mg·kg－1）.They were given relevant medicine intragastrically once a day for consecutive 30 days.MDA，SOD，CAT，NO，GSH-Px，total antioxidant capacity（T-AOC）were all detected in serum，hypothalamus and heart.RESULTS：The optimal prescription of gypenosides nanoemulsion was as follows：RH40，IPM.propylene glycol，water（Km＝3∶1），average diameter of 35.8 nm.Compared with acute aging model group and aged model group，the levels of SOD，CAT，T-AOCand GSH-Px in serum，hypothalamus and heart of gypenosides nanoemulsion high-dose，middle-dose and low-dose groups increased significantly（P＜0.05），while the contents of NO and MDA decreased significantly（P＜0.05）.CONCLUSION：Gypenosides nanoemulsion is good against aging，in a dose dependent manner.

Gypenosides；Nanoemulsion；Anti-aging；D-galactose；Subacute aging model；Aged model；rat；Pseudo-terngky phase diagram

R283.6；R944.1；R339.3

A

1001-0408（2012）39-3654-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.39.03

2011-12-06

2012-06-03）