蕎麥抗感染多肽研究進展

李宗杰 周一鳴 周小理

蕎麥抗感染多肽研究進展

李宗杰 周一鳴 周小理

(上海應用技術學院，上海 201418)

近年來，國內外學者在蕎麥種子內發現了很多抗菌肽、抗腫瘤多肽以及胰蛋白酶抑制劑等抗感染多肽，這些多肽的結構特征和實際應用的研究越來越受關注。主要綜述了蕎麥抗感染多肽的分子結構特征，抗菌、抗腫瘤、胰酶抑制等生理活性及其作用信號機制等方面的研究進展。

蕎麥 蕎麥抗感染多肽 抗菌肽 抗腫瘤多肽 胰蛋白酶抑制劑

抗感染多肽是構成宿主生物初級免疫系統的重要分子基礎，是宿主生物防御微生物感染的天然屏障，主要包括蕎麥抗菌肽［1－2］、蕎麥抗腫瘤多肽［3］以及蕎麥胰蛋白酶抑制劑［4］。蕎麥作為一種重要的糧食作物，研究其體內的抗菌肽等化學成分的結構、功能及作用機制具有重要意義。目前國內外相關研究報道較少，因此，蕎麥抗感染多肽的生理活性、作用機理、分子結構及編碼基因序列等領域非常值得深入研究和探討。

事實上，相當一部分蕎麥抗感染多肽往往不只具有一種生物活性，如蕎麥抗真菌多肽兼有抗腫瘤活性和抗病毒活性［2］，而蕎麥胰蛋白酶抑制劑兼有抗菌活性［4］或者抗腫瘤活性［5－8］。蕎麥多肽在降血糖、降血壓的同時，還具有清除自由基等抗氧化活性。因此，蕎麥抗感染多肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染、提高機體免疫力等研究領域有著很好的應用前景。

本文主要綜述了近幾年蕎麥中被發現的多種抗感染多肽的結構特征及其抗細菌、抗真菌、抗腫瘤等生理活性，分析了國內外在該領域取得的研究進展，為研究蕎麥多肽的分子結構、編碼基因、生理功能以及實際應用提供了思路，為設計、加工、制備蕎麥活性肽提供基礎信息，同時也為研究蕎麥抗感染多肽在功能性食品中的應用提供理論支持。

1 蕎麥抗菌肽的結構及功能

Fujimura等［1］在甜蕎中分離得到的兩個蕎麥抗菌肽Fa－AMP1和Fa－AMP2相對分子質量分別是3 880 Da和3 907 Da，兩者一級結構十分相似，僅僅在C末端有一個氨基酸不同，同源性高達97．5%。后來，Leung等［2］分離的蕎麥抗真菌多肽的相對分子質量為3 911 Da，遺憾的是測序后僅僅得到N端15個氨基酸序列。但是這部分氨基酸序列與Fa－AMP1、Fa－AMP12的N端序列完全一致，因此該抗真菌多肽的分子結構有待于繼續闡明。

目前，已經在蕎麥［1－2］、小麥［9］、蘿卜［10］等十幾種植物中發現了抗菌肽。經過序列比對發現［11］，植物抗菌肽一級結構存在著相當保守的序列(見表1)，即分子內都含有8個半胱氨酸(Cys)，組成4對分子內二硫橋。二硫橋是體外合成多肽技術面臨的重要難題，合成1～2對分子內二硫橋的準確配對率已經有較高的技術要求，合成4對分子內二硫橋的技術難度較大，本實驗室與合作單位就合成蕎麥抗菌肽進行了多次嘗試，經質譜、測序鑒定尚未得到純度較高、二硫鍵配對準確的目標多肽。然而，體外分離天然蕎麥抗菌肽或抗菌蛋白也頗費時費力，設計引物克隆蕎麥抗感染多肽的編碼基因，轉染原核生物進行體外表達將會是短時間得到大量多肽產物的好方法。

由于植物抗菌肽氨基酸序列與人體防御素、昆蟲防御素相似，二級結構上形成3段反平行的β折疊和一個與之相伴隨的α螺旋，因此三維結構的折疊方式也基本相似，所以統稱為植物防御素(Plant defensins)［11－12］。結構的相似性決定了其生理功能也大致相同，抗菌肽的作用機制是通過將α螺旋插入微生物細胞膜形成離子通道而殺死病原菌。研究表明，培養液中不同離子強度對抗菌肽抑菌活性影響不同，一般來說二價離子比一價離子作用強，而二價離子中Ca2+比Mg2+作用強。但是，植物防御素對人體和植物細胞本身沒有明顯的毒性對真菌等微生物卻有很強的殺傷力和廣譜抗菌性。

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抗菌活性研究發現Fa－AMP1和Fa－AMP2具有抗菌光譜性，對革蘭氏陽性菌——密西根棒形桿菌(Clavibacter michiganesis)和萎蔫短小桿菌(Curtobacterium flaccumfaciens)、革蘭氏陰性菌——軟腐病菌(Erwinia cartovora)、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)和毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)以及真菌——尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和白地霉菌(Gotrichum candidum)都有明顯地抑菌作用。而另一個蕎麥抗真菌多肽除了抑制尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)增殖外，還可以抑制花生褐斑病菌(Mycosphaerella arachidicola)的生長。更有意義的是，該抗真菌多肽還可抑制肝癌細胞HepG2、肺癌細胞WRL68、乳腺癌細胞MCF－7以及白血病細胞L1210四種腫瘤細胞系的生長，甚至還可抑制艾滋病病毒HIV－1的逆轉錄酶活性。

2 蕎麥蛋白提取物和蕎麥抗腫瘤多肽的研究概況

蕎麥蛋白提取物(Buckwheat protein extract，BWPE)是包含多種化學組分的混合物，包括蛋白質、脂肪、非纖維素碳水化合物等［13－14］。動物試驗表明，食用蕎麥蛋白提取物可以通過降低雌二醇緩解乳腺癌的癥狀［15］;給大鼠飼喂蕎麥蛋白提取物可抑制結腸癌細胞增殖，從而使結腸癌的患病幾率降低47%［16］。

Guo等［3］將蕎麥水溶蛋白進行分離純化，得到了一個相對分子質量為57 000 Da的多肽，并命名為TBWSP31。抗腫瘤活性檢測發現TBWSP31對人乳腺癌細胞株Bcap37細胞有明顯的增殖抑制作用，且存在時間效應和劑量效應。進一步研究發現，TBWSP31通過引起Bcap37 G0/G1細胞周期阻滯誘導細胞凋亡，其信號分子機制是通過上調細胞凋亡基因Fas和下調細胞凋亡抑制基因bcl－2實現的［17］。目前本實驗室已經在蕎麥中分離純化得到一個相對分子質量為38 000 Da的活性蛋白(數據未列出)，其二級結構等相關研究正在進行中。

3 蕎麥胰蛋白酶抑制劑的研究現狀

自從1983年Ikeda首次從蕎麥種子中分離得到胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)以來［18］，國內外學者先后發現了很多蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Buckwheat trypsin inhibitor，BWI)亞型［19－23］，對其理化性質、氨基酸序列、編碼基因、三維結構等方面的研究不斷深入。目前，蕎麥胰蛋白酶抑制在抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病病毒、醫藥方面應用以及抗病蟲害等農業生產領域的應用備受關注。

據 Dunaevsky等［4］報道，BWI－1可以抑制鏈格孢菌(Alternaria alternataand)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)等真菌的孢子和菌絲體生長。1995年，Belozersky等［19］克隆得到編碼蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI－1a的基因，并將其命名為ISP，很遺憾的是并沒有在GenBank登錄。14年后，俄羅斯科學家將BWI－1的編碼基因ISP轉染西紅柿植株后，發現可以抑制番茄病原細菌Pseudomonas syringae pv．tomato和 Clavibacter michiganensis sbsp．michiganensis有明顯的抑菌活性［24］。此外，據報道重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑編碼基因(GenBank登錄號:AY335158和DQ289792)的體外原核表達的產物rBTI對人白血病細胞 HL－60，K562，IM－9細胞系、人食管鱗癌EC9706細胞系，肝癌HepG2細胞系和人宮頸癌 He-La細胞系都有一定的生長抑制活性［5－8］。通過研究重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI)晶體的三維結構發現，結合牛胰蛋白酶后 rBTI分子的 P8'位點的氨基酸殘基Trp53構象變化，因此，野生型rBTI及其突變體做為研究設計新型抗腫瘤藥物的先導化合物具有很好的研究前景［25］。

4 研究展望

蕎麥抗菌肽、抗腫瘤多肽以及胰蛋白酶抑制劑等抗感染多肽的理論研究和實際應用取得了一定的進展，但是蕎麥抗感染多肽的編碼基因、高級結構以及作用的信號機制等領域值得深入研究和進一步闡明。蕎麥抗菌肽可以作為新型肽類抗生素，但在人體內的代謝動力學研究尚未見報道;蕎麥抗腫瘤多肽對腫瘤細胞的體外試驗取得了很好的試驗結果，但分離純化后的高純度樣品在癌癥病人的臨床研究尚未開始;蕎麥胰蛋白酶抑制劑BWI作為醫藥領域的先導化合物有很好的應用前景，但其抑制絲氨酸蛋白酶的生理活性也尚未引起足夠重視。

總之，如何將蕎麥抗感染多肽在功能性食品、食品添加劑以及藥物領域廣泛應用已迫在眉睫，尚需加大投入深入研究。

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Advance of Studies on Buckwheat Anti－infection Peptide

Li Zongjie Zhou Yiming Zhou Xiaoli
(Shanghai Institute of Tech－nology，Shanghai 201418)

Recently，large amount of anti－infection peptides were identified from buckwheat seeds bu foreign and domestic scholars，such as anti－microbial peptide，anti－tumor peptide，trypsin inhibitor and so on．The structural characterization and practical application of these peptides attracted more and more interest of investigators all over the world．In this paper，the advances in structural characterization，biological activities like anti－ microbial，anti－tumor and trypsin inhibitory activities，and the signal mecha-nism of buckwheat anti－ infection peptides were reviewed．

buckwheat，anti－infection peptide，anti－microbial peptide，anti－tumor peptide，trypsin inhibitor

TS219

A

1003－0174(2012)01－0120－04

國家自然科學基金(31071527)

2011－04－25

李宗杰，男，1982年出生，講師，生物活性肽結構功能

周小理，女，1957年出生，教授，食品新資源及其功能