HPLC測定大鼠肝微粒體溫孵體系中二氫血根堿的含量

伍 勇，劉兆穎，姚芳芳，朱若岑，孫志良

(1.湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128;2.湖南農業大學東方科技學院，長沙 410128)

血根堿是一種苯菲啶異喹啉類生物堿，主要存在于罌粟科、藍堇科及蕓香科的植物中，具有抗菌、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、增強免疫力、殺蟲及促進動物生長等作用［1］。國內外研究者已經對血根堿的提取分離、藥理作用、毒理作用等方面開展了較深入的探索，但對血根堿的藥物代謝研究甚少，僅有一些以大鼠作為試驗動物的初步研究，從報道中僅獲知將大鼠灌胃血根堿后，二氫血根堿的生成是血根堿在體內代謝的主要途徑［2］。同時，在血根堿轉變成二氫血根堿這個過程中，參與的代謝酶研究未見任何報道。因此，建立血根堿的代謝產物二氫血根堿的液相色譜測定法，為研究參與血根堿代謝的酶奠定基礎，亦為今后的臨床合理使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津2010AHT高效液相色譜儀(SIL－20A自動進樣器、SPD－20A紫外－可見檢測器、LCSolution工作站)(島津企業管理(中國)有限公司);Hermle Z383K低溫高速離心機(德國HERMLE(中國)有限公司);Sartorius TE 212－L電子天平，感量0.0001 g(北京賽多利斯公司)。

1.1.2 試藥 血根堿(湖南美可達股份有限公司，批號20110626，純度＞98%);二氫血根堿(湖南美可達股份有限公司，批號20110428，純度＞98%);還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Roche公司，批號110322);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.3 動物 成年健康雄性清潔級SD大鼠，體重180～220 g，長沙市東創實驗動物科技服務部提供(實驗動物許可證號SCXK(湘)2009—0012)。

1.2 方法

1.2.1 鈣沉淀法制備肝微粒體 大鼠斷頭處死，用冰冷生理鹽水通過肝門靜脈灌洗肝臟后，紗布吸干水分稱重，再將肝組織剪碎片至1 cm3左右，然后加入4倍肝組織重量的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液制成20%(W/V)的勻漿液。所得勻漿液在6000 r/min，4℃離心20 min，所得上清液按1 mL加入88 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL的比例進行混合，冰浴放置5 min后于14000 r/min，4℃離心15 min，沉淀為肝微粒體，適量0.05 mol/L Tris－HCl液(pH 7.4)重懸，－80℃保存備用，并采用Bradford法測定肝微粒體蛋白濃度［3］。

1.2.2 定量方法

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱 SHIMADZU VPODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為水 － 乙腈 (37∶63，V/V);流速1 mL/min;檢測波長285 nm;柱溫35 ℃;進樣量 10 μL。

1.2.2.2 對照品溶液制備及標準曲線溶液配制精密稱取二氫血根堿對照品0.0068 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻配成2 mmol/L二氫血根堿甲醇儲備溶液。然后加入空白肝微粒體，用0.05 mol/L Tris－HCl緩沖液 (pH 7.4)稀釋成1000、500、100、50、25 nmol/L 二氫血根堿溶液。

1.2.2.3 方法專屬性 分別設置空白肝微粒體組、空白肝微粒體加二氫血根堿組和生成二氫血根堿的溫孵反應體系組，按1.2.2.1項下色譜條件進行測定。

1.2.2.4 最低檢測限 取二氫血根堿標準貯備液適量，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋成濃度較低的一組樣品，每個濃度測定5次，記錄每次測得的信號強度S與背景信號強度N，以能達到S/N=3時樣品的最低濃度為最低檢測限。

1.2.2.5 線性關系 將標準曲線溶液按 1.2.2.1項下色譜條件進行測定，以峰面積(A)為橫坐標，藥物濃度(C)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.6 精密度試驗 在肝微粒體溫孵液中加入二氫血根堿標準液，使二氫血根堿的濃度分別為50、100、500 nmol/L，按1.2.2.1 項下色譜條件測定二氫血根堿的日內、日間RSD。

1.2.2.7 回收率試驗 配制二氫血根堿濃度分別為50、1000 nmol/L的肝微粒體樣品各5份，照1.2.2.1項下色譜條件進行測定。

1.2.2.8 穩定性試驗 分別取 50、100、500 nmol/L二氫血根堿標準液，分別置室溫、－20℃反復凍溶3次，再測試其含量，考察其的穩定性。

1.2.3 肝微粒體溫孵反應體系與樣品處理 肝微粒體溫孵反應體系總體積為300 μL，組成依次為:60 μL 蛋白濃度為10 mg/mL 的肝微粒體，30 μL 濃度為100 μmol/L 血根堿溶液，30 μL 濃度為 20 mmol/L NADPH 溶液，用 0.05 mol/L Tris－ HCl緩沖液(pH為7.4)加到所需體積。此反應體系反應后用等體積冰冷乙腈終止反應，12000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm 的有機膜，濾液按色譜條件項下操作進行分析。

2 結果

2.1 方法專屬性 從空白肝微粒體組、空白肝微粒體加二氫血根堿組和生成二氫血根堿的溫孵反應體系組的色譜圖(圖1－圖3)可以看出，二氫血根堿峰形較好，與其他峰分離良好，且在肝微粒體中無內源性物質的干擾，說明本方法的專屬性較好。

2.2 最低檢測限 當 S/N≥3時，檢測限為10 nmol/L。

2.3 線性關系 在25～1000 nmol/L范圍內，二氫血根堿(DHSA)的響應與濃度成良好的線性關系。線性方程為 Y=33.5X+555.09，相關系數 r=0.9996。

2.4 精密度 50、100、500 nmol/L 3種濃度的標準溶液其日內 RSD 分別為2.26%、2.57%、3.02%，日間 RSD 分別為 6.21%、4.33%、3.95%，滿足方法學的要求。

2.5 回收率 50、1000 nmol/L的二氫血根堿肝微粒體樣品回收率結果見表1，結果滿足方法學的要求。

表1 回收率測定結果(±s，n=5)

表1 回收率測定結果(±s，n=5)

加入量/(nmol·L －1)實測濃度/(nmol·L －1) 回收率/%50 50.86 ±1.30 101.72 ±2.60 1000 9882.02 ±26.28 98.82 ±2.63

2.6 穩定性 50、100、500 nmol/L二氫血根堿標準液在不同條件的穩定性考察結果見表2，表明二氫血根堿標準液在室溫與－20℃較穩定。

表2 穩定性試驗結果(±s，n=5)

表2 穩定性試驗結果(±s，n=5)

加入量/nmol·L －1)室溫實測濃度/(nmol·L －1)RSD/%－20℃實測濃度/(nmol·L －1)RSD/%50 49.05 ±1.17 2.39 50.13 ±3.19 6.37 100 98.42 ±2.61 2.65 97.86 ±5.11 5.22(500 493.38 ±14.21 2.88 487.90 ±15.52 3.18

3 討論

樣品處理方法優化過程中，結合相關提取方法［4－6］，分別嘗試使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯進行提取，對比發現甲醇沉淀蛋白不完全，乙酸乙酯提取率低，而乙腈的提取效率高，且峰形好。

本實驗建立的肝微粒體孵育體系中二氫血根堿的HPLC測定方法，在所用色譜條件下基線穩定，二氫血根堿保留時間適中，與肝微粒體孵育體系中其他成分完全分離，且峰形好，具有快速簡便、靈敏度高、重現性好等優點，可適用于血根堿在大鼠肝微粒體中代謝產物二氫血根堿的定量以及酶促反應動力學研究。

［1］ 張啟東，黃路枝，胡兆農，等.30種藥用植物提取物殺蟲殺菌活性研究［J］.西北植物學報，2006，26(6):1223 －1230.

［2］ Jitka Psotová，Borivoj Klejdus，Rostislav Vecera，et al.A liquid chromatographic－mass spectrometric evidence of dihydrosanguinarine as a first metabolite of sanguinarine transformation in rat［J］.Journal of Chromatography B，2006，830(1):165 －172.

［3］ 徐叔云.藥理學實驗方法［M］.北京:人民衛生出版社，2002:511－512.

［4］ 羅忠勇，曾建國，黃 敬，等.RP－HPLC法測定小果博落回中7種異喹啉類生物堿［J］.醫學教育探索，2010，41(7):1188－1190.

［5］ 張劍勇，羅 楊，金曉峰.高效液相色譜法測定甘草顆粒中甘草酸的含量［J］.中國獸藥雜志，2011，45(7):32 －34.

［6］ 任 杰，姚敬明，吳果桃，等.HPLC測定石榴皮提取物顆粒劑中不同時期鞣花酸含量的變化［J］.中國獸藥雜志，2012，46(2):30－32.