柴胡、黃芩及其配伍抗大鼠肝纖維化作用研究*

李 敏，王 斌，侯建平，楊 艷

（陜西中醫學院藥學院，咸陽 712046）

肝纖維化是各種致病因子累及肝臟后的一種病理狀態，由各種慢性肝病引起，進一步將發展為肝癌。盡管肝纖維化的病因不同，但其病理特點基本一致：肝臟星狀細胞（HSC）活化是肝纖維化形成的細胞基礎，以膠原為代表的肝臟細胞外基質（ECM）代謝失衡，生成大于降解是其生化學基礎。臨床若能在早期采取抗纖維化措施，有可能使之停止發展或逆轉[1]，對于多種慢性肝病治療有積極意義。中藥抗肝纖維化具有獨特療效，多采用舒肝理氣、活血化瘀類中藥，多年來實踐證明中醫藥在抗肝纖維化中具有良好作用與發展前景[2]。

柴胡、黃芩臨床常用于多種肝病的治療，具有較好抗肝纖維化作用[3-6]。有資料表明柴胡、黃芩配伍后保肝護肝作用明顯增強[7-10]，但兩藥配伍后如何發揮抗肝纖維化的協同作用，相關研究較少。本實驗探討柴胡、黃芩及其配伍對抗肝纖維化的作用，闡明柴胡-黃芩抗肝纖維化的關鍵環節及作用機制，為柴胡及黃芩防治肝纖維化提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠40只（200±5）g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（陜）2007-001。

1.2 試劑 乙醇（國產分析純 天津市天力化學試劑有限公司）；四氯化碳（CCl4）（天津市天力化學試劑有限公司）；膽固醇(成都市精誠生化制品有限公司)；多聚甲醛(天津市科密歐化學試劑有限公司)；烏拉坦（上海華凱科技貿易公司）。透明質酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、層黏蛋白(LN)、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）（南京建成生物工程研究所、南京建成科技有限公司）。

1.3 藥材 柴胡（傘形科多年生草本植物，北柴胡的干燥根），黃芩（唇形科多年生草本植物黃芩的干燥根）。購自百姓樂大藥房，經鑒定為正品藥材。柴胡、黃芩、柴胡∶黃芩（2∶1）提取工藝如下：根據藥物理化性質及臨床用藥習慣，采取水提取工藝，具體為浸泡0.5 h，第1次加7倍量水，煎煮0.5 h，第2次給藥渣中加5倍量水，煎煮0.5 h，過濾，合并濾液，濃縮為1.8 g/mL，4℃儲存備用。

1.4 實驗儀器 電子天平（上海天普分析儀器有限公司型號：JH1102），水浴鍋（國華電器有限公司，型號：HH-2），酶標儀（南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司，型號：DG5033A），離心機（上海安亭科學儀器廠制造，型號：TDL80-2B）；烘箱（天津匯科儀器設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 肝纖維化模型復制 采用復合因素塑造肝纖維化大鼠模型，大鼠適應性喂養3 d后，開始飲10%乙醇，飼喂高脂飼料（含玉米粉89.5%、豬油10%、膽固醇0.5%），1周后皮下注射40%四氯化碳（CCl4）橄欖油溶液5 mL/kg，以后根據大鼠體質量變化情況，每周2次（周三、周六）皮下注射40%CCl4溶液3 mL/kg，連續 3 周。

2.2 分組給藥 大鼠按體質量編號后采用隨機數字表法隨機分為5組：即正常對照組、肝纖維化模型組、柴胡水煎液組（18 g/kg）、黃芩水煎液組（18 g/kg）、柴胡-黃芩合煎液組（18g/kg）。模型建立后，柴胡水煎液組、黃芩水煎液組、柴胡-黃芩（2∶1）合煎液組灌胃給藥10 mL/kg，模型組及正常對照組灌胃等量蒸餾水，每日1次，連續7 d。

2.3 HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C測定 第7天晚禁食不禁水12 h，次日腹腔注射烏拉坦（1.0 g/kg）麻醉，腹主靜脈取血，分離血清。按試劑盒說明書操作，用酶聯免疫吸附法（Elisa法）測定血清中HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C含量。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

2.4 統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

實驗結果顯示，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常對照組明顯升高。柴胡-黃芩（2∶1）能降低肝纖維化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量值，與模型組比較有統計學意義（P<0.05）；柴胡、黃芩及柴胡-黃芩（2∶1）均能降低血清LN，其中柴胡、黃芩作用顯著（P<0.05），柴胡-黃芩（2∶1）作用非常顯著（P<0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

表1 各組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C的含量（±s，n=8）Tab.1 Content of serum HA,PCⅢ,LN andⅣ-C in each group(±s，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 劑量（g/kg）PCⅢ Ⅳ-C HA LN正常對照組 - 8.85±2.79**22.55±5.84*153.25± 6.85**34.50±2.96**模型組 - 16.82±4.2129.63±6.03227.86±18.7450.57±6.64柴胡組 1812.50±2.6427.33±2.46179.87±10.1740.76±5.70*黃芩組 1813.45±1.7828.44±7.91189.61±11.3443.49±3.81*柴胡-黃芩組 12+610.50±2.64* 26.36±2.92*154.31± 9.47* 39.12±6.39**

4 討論

大多數肝硬化都是由肝纖維化的各種慢性肝病發展引起，因此能在肝纖維化早期進行抑制或逆轉，對于各種慢性肝病有積極治療意義。

參與肝纖維化形成的細胞外基質成分包括膠原蛋白、蛋白多糖和非膠原性蛋白。HA是構成蛋白多糖的主要成分，肝臟受損時，HSC合成的HA會明顯增加，而內皮細胞受損使血液中的HA攝取和降解減少，因而血液中HA水平升高。Ⅲ型前膠原反映肝內Ⅲ型膠原合成，血清PCⅢ含量增高與肝細胞炎性反應和壞死導致肝內Ⅲ型膠原裂解增加有關，直接反映Ⅲ型膠原的代謝狀況。LN大量沉積可引起肝竇毛細血管化，其血清值是反映基底膜更新率的指標，可反映肝竇的毛細血管化和匯管區纖維化。Ⅳ－C是基底膜的主要成分，反映基底膜膠原的更新率，與肝纖維化程度呈正相關。因此肝纖維化時HA、PCⅢ和Ⅳ-C的含量變化最明顯，是反映肝纖維化最敏感的指標[11]。

柴胡、黃芩是臨床常用的抗肝纖維化中藥，對其相關機制有一定深入的研究，柴胡是通過抑制肝炎和肝星狀細胞活化，其中深層機制可能與上調過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）表達有關[3-4]。黃芩抗肝纖維化作用，包括減少肝臟羥脯氨酸含量，降低肝區平滑肌細胞α-肌動蛋白陽性表達，激活caspase-3，caspase-9，促進ERK-P53的途徑，導致最終HSC-T6細胞凋亡，降低血清酶學異常，能改善肝纖維化病理形態等[5-6]。兩者配伍顯示出增強的保肝作用，其中以柴胡-黃芩（2∶1）效果為佳[7]，故本實驗柴胡-黃芩（2∶1）配伍探討其抗肝纖維化效應。

復合因素（包括高脂飼料、乙醇和CCl4）的給與是一種快速可靠復制肝纖維化模型的方法[12]，因此作為實驗造模方法。實驗結果顯示，模型組大鼠血清中HA、PCⅢ、LN和Ⅳ-C比正常對照組明顯升高。柴胡-黃芩（2∶1）能降低肝纖維化大鼠血清中HA、PCⅢ和Ⅳ-C 的含量值（P<0.05）；柴胡、黃芩及柴胡-黃芩（2∶1）均能降低血清 LN，其中柴胡、黃芩作用顯著（P<0.05），柴胡-黃芩（2∶1）作用非常顯著（P<0.01）。

本實驗結果表明，柴胡-黃芩（2∶1）配伍治療肝纖維化比柴胡、黃芩單味中藥效果更明顯。其作用機制可能與配伍藥物相互之間體內代謝動力學影響有關。針對這些方面，有必要進一步結合藥代動力學研究，探討肝纖維化狀態下的藥物配伍后代謝行為對藥效影響。

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