增強免疫力的靈芝孢子保健膠囊的研制

李捷，鄭曉艷，左蕾蕾，向晉龍，曾凡駿，*

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.四川麥力若科技發(fā)展有限責任公司，四川 成都 610065）

免疫力是人體自身的防御機制，是識別和消滅外來侵入異物，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細胞以及識別和處理體內(nèi)突變細胞和病毒感染細胞的能力。免疫功能過低使機體不能及時清除有害的物質(zhì)，對于入侵的外來物質(zhì)缺乏抵抗力，容易發(fā)生腫瘤和各種病原微生物感染。靈芝孢子是靈芝的生殖細胞，含有比靈芝更豐富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成分。

1 材料與方法

1.1 配方原料及功能

1.1.1 靈芝孢子

靈芝孢子具有增強免疫、抗腫瘤、護肝、降血脂、降血糖、清除自由基、消炎抗炎等功效。在增強免疫力，抑制腫瘤的藥效方面都超過其母體靈芝[1]。

1.1.2 VC

VC作為營養(yǎng)增補劑，可防治壞血病、齒槽膿漏、貧血、食欲不振以及防治糖尿病的慢性病發(fā)癥、防治感冒和流感、延緩衰老、預防腫瘤、動脈粥樣硬化、皮膚病、中風和預防血管性癡呆和早腦性癡呆的神經(jīng)退化等。

1.2 破壁靈芝孢子粉的制備

1.2.1 滅菌工藝研究

對未破壁靈芝孢子粉進行干熱滅菌、常壓蒸汽滅菌以及高壓蒸汽滅菌的方法考察。通過滅菌后靈芝孢子粉的外觀狀態(tài)及微生物限度作為判定指標，以確定合理的滅菌方式及參數(shù)。

1.2.1.1 主要試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂，乳糖膽鹽，氯化鈉，乙醇，0.1 mg/mL齊墩果酸標準液，冰乙酸，高氯酸，5%的香草醛-冰醋酸溶液，0.1 mg/mL葡萄糖標準液，0.2%蒽酮硫酸溶液。

AR2130 型電子天平：Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA.；UV-1100型紫外-可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；DSY-1-4孔型電熱恒溫水浴鍋：北京愛琦霞商貿(mào)中心；01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌筒：上海博迅實業(yè)有限公司；SP-DJ系列水平凈化工作臺：上海浦東物理光學儀器廠；HHB11-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海峪麗電子科技有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.2.1.2 方法

稱取4 g未破壁靈芝孢子粉6份作為樣品，分別置于常壓沸水蒸汽中15 min及30 min；高壓滅菌鍋121℃，30 min；80℃烘箱中 1 h及 2 h；75%乙醇中浸泡10 min烘干。得出對靈芝孢子粉滅菌后無明顯感觀變化且對破壁工藝無影響的滅菌條件。再將此滅菌條件滅菌后的樣品進行微生物指標的檢測；條件最合理者再進行功效成分的檢測，確定最終滅菌工藝。

1.2.2 破壁靈芝孢子制備工藝流程

計量稱重→滅菌→干燥→破壁→破壁靈芝孢子粉

1.3 膠囊制劑工藝

1.3.1 粘合劑的選擇

1.3.1.1 主要試劑和儀器

無水乙醇，淀粉，蒸餾水。

AR2130 型電子天平：Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA.；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.3.1.2 實驗方法

稱取20 g破壁靈芝孢子粉，分別以水、80%乙醇、淀粉-水、淀粉-80%乙醇溶液作為粘合劑。在一定粘合劑用量下，考察粘合效果。

1.3.2 膠囊制劑工藝流程

原料→檢測→計量稱重→混料→制粒→干燥→總混→裝填→拋光→內(nèi)包裝→外包裝→檢驗→成品入庫

1.4 安全性毒理學評價及功能評價

1.4.1 安全性毒理學評價

1）急性經(jīng)口毒性試驗；2）遺傳毒性試驗；3）大鼠30 d喂養(yǎng)試驗。

1.4.2 增強免疫力功能評價

實驗設 333、667、1000 mg/kg·bw 三個劑量組（分別相當于人體推薦量的10、20、30倍），對靈芝孢子膠囊進行對小鼠臟器/體重比值測定，遲發(fā)型變態(tài)反應，ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，血清溶血素測定，抗體生成細胞檢測，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗，小鼠碳廓清實驗，NK細胞活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方用量確定

根據(jù)文獻資料的研究表明，人體服用靈芝孢子粉0.45 g/d～16.2 g/d區(qū)間內(nèi)，具有顯著的提高缺氧耐受力的功能（P<0.05）及很高的安全性。本產(chǎn)品配方中靈芝孢子粉的每日服用量為1.92 g/d，并輔以VC協(xié)同作用，具有良好的增強免疫力的功能。

2.2 破壁靈芝孢子粉的制備

2.2.1 滅菌工藝研究

不同滅菌方法滅菌后靈芝孢子粉的感觀指標變化情況見表1。

表1 不同滅菌方法滅菌后靈芝孢子粉的感觀指標變化情況Table 1 Sensory indexes of Ganoderma Lucidum Spore Powder after different sterilizations

由表1看出，方法6經(jīng)浸泡后不易烘干且結(jié)塊，不利于破壁，故排除此方法。對前5個滅菌方法后的樣品進行大腸桿菌定性檢測和菌落總數(shù)的檢測，結(jié)果見表2。

表2 大腸桿菌定性檢測和菌落總數(shù)的測定Table 2 E.coli qualitative tests and the determination of total bacterial colonies

由表2可知，按照方法1、2、3滅菌都能初步達到相應的微生物及感觀要求，考慮到操作的難易程度、能源消耗等因素，初步選定方法1。對此法滅菌處理后的樣品進行全面的微生物指標檢測及破壁后的功效成分檢測，檢測結(jié)果如表3和表4所示。

表3 方法1滅菌樣品微生物指標檢測結(jié)果Table 3 Microbial test results of method 1

表4 方法1滅菌樣品破壁后功效成分檢測結(jié)果Table 4 Efficacy component test results of method 1 g/100 g

由表3、表4可知：常壓蒸汽15 min（100℃）即可將靈芝孢子粉中微生物有效殺滅滿足產(chǎn)品的微生物指標，且滿足感觀要求其功效成分含量要求。

2.2.2 破壁靈芝孢子中試制備

1）滅菌：根據(jù)實驗所得最佳條件，即溫度為100℃，滅菌時間設定為15 min。2）干燥：干燥溫度60℃～70℃，干燥時間為1 h左右，干燥至物料水分5%左右。3）破壁：SYFM-8 PR型振動微粉碎機碾磨破壁，破壁時間30 min，產(chǎn)品粒度 5μm，破壁環(huán)境溫度±5 ℃，破壁率≥96.0%。

2.3 膠囊制劑工藝

2.3.1 粘合劑的選擇

破壁靈芝孢子粉未加粘合劑時，休止角為42.8°，堆密度為0.31 g/cm3。為改善孢子粉的流動性，增加其堆密度使裝填量達到要求。對粘合劑的選擇實驗結(jié)果見表5。

表5 粘合劑的選擇Table 5 The choice of adhesives

由表5實驗結(jié)果可知，添加2%淀粉先混料均勻后，再添加80%乙醇作為粘合劑，其休止角和堆密度即可達到要求，且短時間易烘干。即產(chǎn)品用量為：每100 kg需淀粉約2 kg，80%乙醇10 kg左右。在此用量下，經(jīng)制粒和總混5 min，物料休止角控制在32°～35°、堆密度0.35 g/cm3～0.40 g/cm3，可見流動性得到了明顯的改善，且保證了裝量的穩(wěn)定性能制出符合要求的物料顆粒。

2.3.2 膠囊制劑工藝

2.3.2.1 檢測

對各原料分別進行相應的感官、理化、微生物指標的檢驗，符合要求的則進行投料。

2.3.2.2 計量稱重

稱重時將易吸潮的物質(zhì)后稱，盡量避免其吸潮。

2.3.2.3 混料

按照產(chǎn)品配方，對各種原料混合，由于配方VC較少且加入少量淀粉進行粘合，混合時采用等量遞增的原則。

2.3.2.4 制粒

高速攪拌制粒，潤濕劑為80%乙醇溶液，每100千克混料需80%乙醇液約10 kg。

2.3.2.5 干燥

制粒完成后，60℃～70℃下沸騰干燥30 min。

2.4 安全性毒理學評價及功能評價

2.4.1 安全性毒理學評價

1）急性經(jīng)口毒性試驗：SD大鼠和KM小鼠的急性經(jīng)口MTD值均大于10g/（kg·bw），按急性毒性分級屬無毒級。2）遺傳毒性試驗：三項遺傳毒性試驗（Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗以及小鼠精子畸形試驗）結(jié)果無致突變作用。3）大鼠30 d喂養(yǎng)試驗：最高劑量為人體推薦量的105倍。長發(fā)育情況和一般表現(xiàn)良好，體重持續(xù)增長，體態(tài)活潑，大、小便未見異常改變。試驗期間未見明顯行為改變和中毒表現(xiàn)。

2.4.2 增強免疫力的功能評價

經(jīng)口給予小鼠（Balb/c）333、667、1000 mg/kg·bw劑量（分別相當于人體推薦量的10、20、30倍）的靈芝孢子膠囊30 d后進行測試。在小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應實驗中，抗原攻擊24 h后，1000 mg/kg·bw劑量組與對照組小鼠相比，其足跖腫脹度有顯著性差異（p＜0.05）。在小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗中，中高級兩組分別與對照組小鼠相比，其光密度差值均有顯著性差異（p＜0.01）。在抗體生成實驗中，1000 mg/kg·bw劑量組與對照組小鼠相比，其抗體生成細胞數(shù)有顯著性差異（p＜0.01）。在小鼠NK細胞活性測定實驗中，667、1000 mg/kg·bw劑量組分別與對照組小鼠相比，其NK細胞活性率均有顯著性差異（p＜0.01）。據(jù)評價標準可認為靈芝孢子膠囊具有增強免疫力的功能。

3 結(jié)論

以靈芝孢子粉為主要原料，輔以VC研制出靈芝孢子膠囊，配方用量經(jīng)文獻及實驗研究具有增強免疫力的功能。

研究了靈芝孢子粉滅菌最優(yōu)方法及條件：100℃蒸汽滅菌15 min。在此條件下進行滅菌，能有效殺滅微生物且功效成分不受影響。對膠囊制劑工藝中粘合劑進行了研究，選擇2%淀粉和80%乙醇作為粘合劑，其休止角和堆密度即可達到要求，且短時間易烘干。

產(chǎn)品經(jīng)安全性毒理學評價表明靈芝孢子膠囊安全無毒；經(jīng)功能評價表明靈芝孢子膠囊具有增強免疫力的作用。

[1]陳軍輝,吳鳳琪,李文龍,等.靈芝孢子粉與子實體中三萜類化合物、多糖及重金屬元素的含量比較[J].中國藥房,2008,19(33):2585-2587

[2]顧欣,王芷源,劉耕陶.靈芝孢子粉的藥理研究1:對動物化學性和過敏性肌炎的保護作用[J].中藥藥理與臨床,1993,15(2):25

[3]盧振,陳金和,王雨來,等.靈芝的研究及應用進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2003,14(9):577-581

[4]馮道俊.靈芝的化學成分、功效及藥理作用[J].特種經(jīng)濟動植物,2006(8):39-40