牛蒡根4種提取物體外抗腫瘤活性的比較研究Δ

趙秀梅，張富賡，沈洪昇，史鵬程，胡人杰#（.天津市醫藥科學研究所，天津 30000；.天津市環湖醫院，天津 300060）

牛蒡（Arctium lappa L.），別名惡實根，屬于菊科牛蒡屬2年生草本植物[1]。牛蒡根為牛蒡的根，主要作為蔬菜或制成保健品廣為食用。目前，對牛蒡根的研究主要集中在抗菌、降血糖、抗衰老及其抗突變方面[2，3]，其抗腫瘤活性方面的研究幾乎是空白。筆者采用系統溶劑提取法對牛蒡根進行提取和初步分離，選擇人乳腺癌細胞MCF-7、人胃腺癌細胞BGC-823、小鼠肝癌細胞HepA、小鼠肉瘤細胞S180和小鼠脾淋巴細胞為觀察對象，對不同極性提取物的生物活性進行初步觀察、比較，探討牛蒡根的進一步研發價值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2孵育箱（美國Revco公司）；Infinite M200 PRO型全波長多功能酶標儀（奧地利Tecan公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；96孔板（德國Greinerbio公司）。

1.2 試藥

牛蒡根為市售品，由天津中醫藥大學馬琳研究員鑒定為真品；RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；MTT、刀豆蛋白A（Con A）均購自北京欣經科生物技術有限公司；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津瑞金特化學品有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇（天津市化學試劑批發公司）。

1.3 動物與細胞株

昆明種小鼠，♀♂兼用，體重18～20 g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供（動物生產許可證號：SCXK（京）2006-2008）。

人乳腺癌細胞株MCF-7、人胃腺癌細胞株BGC-823、小鼠肝癌腹水型細胞株HepA和小鼠肉瘤腹水型細胞株S180均由天津市醫藥科學研究所細胞室提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

取牛蒡根干燥粗粉適量，乙醇回流提取3次，合并醇提液，減壓回收溶劑，浸膏加適量水成混懸液，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。將各萃取液分別濃縮，得石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層。用前以含10%小牛血清的RPMI 1640培養液配制并進行倍量稀釋。

2.2 樣品對體外培養腫瘤細胞生長的影響[4]

取對數生長期MCF-7和BGC-823細胞，經0.25%胰酶消化后，吹打成單細胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞濃度為1×105個/mL，以每孔100 μL分別接種于96孔培養板中，培養24h待細胞貼壁。另外再抽取HepA和S180細胞小鼠腹水，PBS洗滌2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀釋成1×106個/mL單細胞懸液，分別接種于96孔培養板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同濃度的待測樣品液100 μL，每個濃度平行4孔。以加入等體積含10%小牛血清的RPMI 1640培養液，使反應體積為200 μL為對照。37℃、5%CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入5 mg·mL－1MTT液10 μL，37℃溫育4 h，1000 r·min－1離心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震蕩，于酶標儀570 nm波長處測吸光度（A）值。藥物半數抑制濃度（IC50）用SPSS13.0軟件進行計算。按下式計算藥物各個濃度對腫瘤細胞的生長抑制率（IR）：IR（%）＝（1－樣品平均A值/對照平均A值）×100%。

2.3 樣品對淋巴細胞增殖的影響[5]

小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下摘取脾臟，收集脾細胞。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞濃度至4×106個/mL。以每孔75μL加于96孔板中，再加入20μg·mL－1Con A溶液25 μL，其余步驟如復孔、對照孔的設置，待測樣品的加入，細胞的培養以及MTT的加入，均按“2.2”項下方法操作，并測定A值。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 牛蒡根提取物對體外腫瘤細胞生長的影響

3.1.1 牛蒡根提取物對MCF-7細胞、BGC-823細胞生長的影響 與對照組比較，牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物對MCF-7和BGC-823細胞的生長均表現出一定的抑制作用。對MCF-7細胞的IC50分別為（213.43±104.38）、（276.42±87.85）、（235.67±189.48）μg·mL－1；對BGC-823細胞的 IC50分別為（380.83±62.64）、（336.21±44.11）、（564.65±84.85）μg·mL－1。牛蒡根提取物對MCF-7細胞生長的抑制作用由強到弱為：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物；牛蒡根提取物對BGC-826細胞生長的抑制作用由強到弱為：氯仿提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物。正丁醇提取物在測試的濃度范圍內對MCF-7和BGC-823細胞沒有顯示出細胞毒活性。牛蒡根提取物對MCF-7細胞、BGC-823細胞生長的影響分別見表1、表2。

表1 牛蒡根提取物對MCF-7細胞生長的影響（n＝4）Tab 1 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of MCF-7cells（n＝4）

表2 牛蒡根提取物對BGC-823細胞生長的影響（n＝4）Tab 2 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of BGC-823cells（n＝4）

3.1.2 牛蒡根提取物對HepA細胞、S180細胞生長的影響 牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物在各濃度范圍內對小鼠HepA、S180細胞均表現出不同程度的生長抑制作用，量效關系基本明確。各提取物對HepA細胞的IC50分別為（56.12±21.47）、（52.85±19.41）、（49.52±36.56）、（84.13±36.69）μg·mL－1；對S180細胞的IC50分別為（7.34±1.65）、（5.36±0.76）、（64.14±12.63）、（33.29±12.14）μg·mL－1。牛蒡根提取物對HepA細胞生長的抑制作用由強到弱為：乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物；牛蒡根提取物對S180細胞生長的抑制作用由強到弱為：氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物。牛蒡根提取物對HepA細胞、S180細胞生長的影響分別見表3、表4。

3.2 牛蒡根提取物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

4種提取物對小鼠脾淋巴細胞（主要是T淋巴細胞）的增殖表現出了明確的抑制作用，這種作用基本上呈劑量依賴性。牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物對淋巴細胞增殖抑制的 IC50分別為（22.22±4.90）、（32.15±3.45）、（31.66±10.65）、（126.45±47.32）μg·mL－1。牛蒡根提取物對脾淋巴細胞生長的抑制作用由強到弱為：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物。牛蒡根提取物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響見表5。

4 討論

表3 牛蒡根提取物對HepA細胞生長的影響（n＝4）Tab 3 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of HepAcells（n＝4）

表4 牛蒡根提取物對S180細胞生長的影響（n＝4）Tab 4 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of S180cells（n＝4）

表5 牛蒡根提取物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（n＝4）Tab 5 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of mice spleens lymphocytes（n＝4）

人們對于牛蒡的研究主要集中于其法定的藥用部位牛蒡子，并已證明其化學成分牛蒡苷具有抗腫瘤活性。牛蒡的非藥用部位牛蒡根作為食品在日本、韓國以及我國臺灣地區受到推崇。

本研究發現，牛蒡根4種不同極性提取物中石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物對體外培養的HepA、S180、MCF-7、BGC-823細胞均表現出明確的生長抑制作用。筆者首次確定了牛蒡根的體外抗腫瘤作用。但研究結果也顯示，MCF-7、BGC-823細胞對樣品的IC50值明顯高于HepA、S180細胞，這可能是由于作為懸浮生長小鼠的腫瘤細胞比貼壁生長的人腫瘤細胞對樣品有更高的敏感度，而且從體積上來講，小鼠的腫瘤細胞也要小于貼壁細胞。研究中筆者還發現，所有樣品對ConA誘導的淋巴細胞增殖均表現出明確的抑制作用，表明牛蒡根的抗腫瘤作用機制與增強細胞的免疫活性無關。以上研究結果均表明牛蒡根提取物確有細胞毒活性。此外，在另一研究中筆者對牛蒡根和牛蒡子進行了初步的成分分析。結果發現，牛蒡根中不含有牛蒡子中特有的抗腫瘤活性成分牛蒡苷，說明牛蒡根中的抗腫瘤活性成分很可能不同于牛蒡子。以往研究證實，菊科植物中含有炔類化合物[6]。20世紀60年代，日本學者從牛蒡根中分離得到了炔類化合物，并證實其具有抗菌活性，而近年來的研究表明，炔類化合物很可能具有抗腫瘤的生物活性[7]。本研究中牛蒡根的抗腫瘤生物活性，是否與其所含的“炔類化合物”相關，有待進一步考察，筆者認為開發牛蒡根作為抗腫瘤的藥物或食品具有一定的物質基礎。對于牛蒡根提取物中有關“活性成分”的分離和藥理學評價尚在進行中，期望得到良好的結果。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：60.

[2]李時珍.本草綱目（校點本第二冊）[M].第1版.北京：人民衛生出版社，1987：985.

[3]時新剛，王 曉，李賽鈺，等.牛蒡食用價值的研究與分析[J].山東食品發酵，2003，4：28.

[4]邵振中，賈曉斌，陳 彥，等.三草方不同極性部位及其配伍后對人肺腺癌SPC-A-1細胞的影響研究[J].中國藥房，2010，21（7）：581.

[5]馬麗娟，李 鵬，宋 宇，等.馬蹄香含藥血清對小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨嗜細胞的影響[J].安徽農業科學，2010，38（29）：16230.

[6]王建平，秦紅巖，張惠云，等.鬼針草提取成分對白血病細胞的體外抑制作用[J].中藥材，1997，20（5）：247.

[7]趙秀梅，胡人杰.天然炔類化合物的研究現狀[J].天津藥學，2007，19（1）：60.