結晶紫-ZnS-BSA光度法測定蛋白質的含量

胡衛平，焦嫚，董學芝，王鑫

（河南大學化學化工學院環境與分析科學研究所，河南 開封 475004）

蛋白質是人類生命活動中最重要的物質基礎，基本組成單位是氨基酸，組成蛋白質的氨基酸有20余種，體內只能合成一部分，其余則由食物蛋白質供給，準確測定蛋白質的含量是評價一種食品質量的重要手段[1]。目前蛋白質含量的測定方法很多，蛋白質的測定方法主要有紫外吸收法[2]、共振瑞利散射法[3]、電感耦合等離子體法[4]、流動注射法[5]等。

紫外分光光度法由于操作簡單、儀器使用方便、測定速度快等優點應用廣泛，目前分光光度法測定蛋白質的研究主要是利用小分子有機染料與蛋白質相結合的光譜探針方面。結晶紫是一種堿性三苯甲烷類染料，已有文獻報道，以結晶紫為顯色劑，與牛血清白蛋白（BSA）作用生成紫紅色配合物，并且吸光度較結晶紫明顯增大，從而測定蛋白質的含量[6]。

但是利用結晶紫與ZnS相結合并用分光光度法測定蛋白質的含量鮮見報道。基于ZnS與結晶紫作用可使結晶紫的吸光度降低，加入不同量的蛋白質，體系的吸光度逐漸增大，并且與BSA濃度在一定范圍內有良好的線性關系。據此，建立了結晶紫-ZnS-BSA分光光度法測定蛋白質含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA）：國藥集團化學試劑有限公司；B-R緩沖溶液（取濃度均為0.04 mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液，用0.02 mol/L的NaOH調至所需pH）；NaH2PO4（0.0175 mol/L）－Na2HPO4（0.0175 mol/L）緩沖溶液（pH=7.00）；巰基乙酸（0.1 mol/L），Zn（Ac）2·2H2O（0.1 mol/L），Na2S（0.1 mol/L），結晶紫（10-4mol/L），濃氨水。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

Labtech-1000紫外-可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；pHS-3CT型酸度計：上海大普儀器有限公司；CL-4型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 ZnS量子點的制備

在80mL的燒杯中，依次加入蒸餾水50mL、Zn（Ac）2·2H2O 5 mL、巰基乙酸5 mL，加熱到70℃，用濃氨水溶液調節pH到8.35。在磁力攪拌器作用下，緩慢加入Na2S 4 mL，攪拌2 h，得到一定粒徑大小的ZnS納米微粒。

1.3 方法

在10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL結晶紫溶液、3.5 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、2 mL ZnS 溶液、含適量BSA的溶液，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。于30℃溫度下反應 15 min，在最大吸收波長（λmax）590 nm處進行測定。

2 結果與討論

2.1 體系的吸收光譜

體系的吸收光譜示于圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum

可以看出BSA與ZnS在可見光區無吸收，結晶紫在590 nm處有最大吸收，加入ZnS溶液反應后使結晶紫吸光度降低，隨著不同量BSA溶液的加入，體系的吸光度逐漸增大。

2.2 酸度對體系吸光度的影響

配制一系列不同pH的B-R緩沖溶液，按照試驗方法，測定不同酸度下的吸光度A，以A對不同酸度（pH）作圖（見圖2）。

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of Acidity

試驗表明，隨著pH的增大，A逐漸降低，但當體系的酸度（pH）在6.0～8.0范圍內，體系A趨于穩定，試驗選擇pH為7.0的緩沖溶液。

試驗對 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉、NaH2PO4-NaOH及B-R緩沖溶液進行選擇，表明pH為7.0的Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液使體系的吸光度增加顯著。

進一步對緩沖溶液的用量進行選擇，見圖3。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of the volume of buffer

試驗表明，隨著緩沖溶液用量的增加，A逐漸增大，在3.5 mL時體系吸光度達到最大。試驗選擇pH7.0的 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4緩沖溶液 3.5 mL。

2.3 結晶紫的用量對體系吸光度的影響

按照試驗方法，固定其他條件不變，取不同體積的結晶紫溶液（10-4mol/L），并測定體系的吸光度，見圖4。

圖4 結晶紫溶液用量的影響Fig.4 Effect of the volume of methyl violet

試驗表明，隨著結晶紫用量的增加，吸光度逐漸增大，在0.5 mL后吸光度增加緩慢，因此選擇10-4mol/L的結晶紫溶液0.5 mL。

2.4 ZnS的用量對體系吸光度的影響

固定其他條件不變，改變ZnS的用量，測定體系的吸光度，以吸光度A對ZnS的用量作圖，見圖5。

試驗表明，隨著ZnS用量的增多，體系的吸光度逐漸降低，當用量達到2.0 mL～3.0 mL時，體系吸光度趨于穩定。選擇ZnS溶液用量為2.0 mL。

圖5 ZnS用量的影響Fig.5 Effect of the volume of ZnS

2.5 反應溫度和時間的影響

用溫度控制儀調節水溫，在20℃～70℃溫度范圍內分別測定溫度對體系吸光度的影響，結果表明，20℃～40℃體系較為穩定，隨著溫度的升高，體系的吸光度逐漸升高，試驗選擇溫度為30℃。

在30℃的溫度下，測定反應時間對體系的影響，見圖6。

圖6 時間的影響Fig.6 Effect of the reaction time

試驗表明，隨反應時間的增加，體系的吸光度逐漸升高，而反應20 min后，吸光度增加緩慢，因此選定反應時間為20 min。

2.6 標準曲線

按照試驗方法，加入不同量的BSA，測定體系的吸光度，以吸光度A對BSA濃度C作圖，見7所示。

試驗表明，A與BSA濃度在0.0100mg/mL～4.400mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為A=2.0406+0.46050 C（mg/mL），相關系數R=0.9962，檢出限為0.009152 mg/mL。

2.7 共存離子的干擾

考察了常見的金屬離子及多種氨基酸對含有5μg/mL BSA體系的影響，結果表明，在±5%誤差允許范圍內，100倍的檸檬酸三鈉、淀粉、甘氨酸、蔗糖、葡萄糖、尿素、安賽蜜、三聚氰胺，50倍的L-谷氨酸，DL-蘋果酸、NaCl、NH4Cl、KCl，25 倍的 FeCl3、FeSO4、AlCl3，同倍的 BaCl2、Mg（NO3）2、Pb（NO3）2對試驗均沒有影響。

圖7 標準曲線Fig.7 The calibration curve

2.8 樣品測定及與標準方法對照

取肉松 6.5160 g、牛奶 1.9949 g、雞精 5.0050 g，分別稀釋定容至100 mL，振蕩5 h，使樣品中蛋白質充分溶解。再取少量乙醚萃取3次除去樣品中的脂肪，棄去溶有脂肪的乙醚層，過濾，濾液即為待測液。按照試驗方法，測定樣品中BSA的含量，且與考馬斯亮藍法做對照，結果見表1。

2.9 加標回收試驗

吸取一定量的樣品測試液，分別加入一定量的BSA標準溶液，按照實驗方法做加標回收試驗，結果見表2，可以看出樣品平均回收率較好，說明該方法較準確。

表1 樣品中BSA的測定結果Table1 Determination results of BSA samples

表2 加標回收試驗Table 2 Recovery test

3 結論

利用ZnS與結晶紫作用，生成復合物，該復合物與蛋白質作用，使體系吸光度顯著增大，采用分光光度法法測定樣品中蛋白質的含量。該方法準確、簡單、快速、線性范圍寬，通過測定樣品并與標準方法做對照，結果滿意，可用于食品中蛋白質含量的測定。

[1]張紅英,王麗,郭愛靜.應用Primacs SN總氮/蛋白質分析儀測定食品中的蛋白質[J].理化檢驗-化學分冊,2007,43(12):976-978

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[3]Long X F,Liu S P,Kong L,et al.A study on the interaction of proteins with some heteropoly compounds and their analytical application by resonance Rayleigh scattering method[J].Talanta,2004,3(63):279-286

[4]Lamer-Déchamps S L,Poucheret P,Pérez J L.Validation of an inductively coupled plasma-mass spectrometry method to quantify tungsten in human plasma.Determination of percentage binding to plasma proteins[J].Clinica chimica acta,2003,327(23):39-46

[5]Ying Li,Lijun Dong,Weiping Wang.Flow injection analysis-Rayleigh light scattering detection for online determination of protein in human serum sample[J].Analytical biochemistry,2006,354(4):64-69

[6]杜鵑.結晶紫分光光度法測定蛋白質的含量[J].化學分析計量,2006,15(4):46-47