環介導等溫擴增技術檢測食品中銅綠假單胞菌

劉偉，侯麗萍，趙良娟，曲鵬，鄭文杰，張宏偉

（天津出入境檢驗檢疫局，天津 300201）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA），革蘭染色陰性菌，在自然界中分布廣泛,為淡水和土壤中最常見的細菌種類之一。空氣、動物皮膚、腸道、呼吸道等處均可有該菌的存在。

銅綠假單胞菌的多種產物有致病性，其內毒素則在發病上無重要意義。其分泌的外毒素A（PEA）是最重要的致病、致死性物質，進入敏感細胞后被活化而發揮毒性作用，使哺乳動物的蛋白合成受阻并引起組織壞死，造成局部或全身疾病過程。動物模型表明：給動物注射外毒素A后可出現肝細胞壞死、肺出血、腎壞死及休克等，如果注射外毒素A抗體則對銅綠假單胞菌感染有保護作用。銅綠假單胞菌尚能產生蛋白酶，有外毒素A及彈性蛋白酶同時存在時則毒力最大；胞外酶S是銅綠假單胞菌所產生的一種不同于外毒素A的ADP-核糖轉移酶，可促進銅綠假單胞菌的侵襲擴散，感染產此酶的銅綠假單胞菌病人，可有肝功能損傷而出現黃疸[1-2]。

擬以銅綠假單胞菌的PEA基因序列為靶序列，設計特異性引物[4-6]，建立食品中銅綠假單胞菌LAMP檢測方法，應用于食品樣品中并與檢驗檢疫行業標準進行比較[3]，為準確快速銅綠假單胞菌的檢測試驗提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗對約36株陽性樣品進行了檢測，其中American Type Culture Collection（ATCC）標準銅綠假單胞菌4株，中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC）標準銅綠假單胞菌8株，實驗室自分離銅綠假單胞菌菌10株，其他來源假單胞菌株CGMCC 14株。本研究所使用的菌株見表1。

1.2 細菌培養

盡管35℃～37℃培養時銅綠假單胞菌生長良好，但干擾菌也同時競爭增殖，降低檢出率。利用銅綠假單胞菌42℃生長的特性，可與其他相關細菌區別，得到較高的陽性證實率。

表1 本研究中使用菌株Table 1 strains of the study

1.3 細菌基因組DNA提取的方法

取1.5 mL過夜菌懸液，根據說明書，用DNA提取試劑盒（Promega公司）提取細菌DNA，所提DNA的溶于50 μL Tris-EDTA緩沖液中，-20℃保存備用。

1.4 引物設計

搜集GenBank已公布基因組全序列銅綠假單胞菌的PEA基因序列。GeneTool軟件進行比對,發現此序列中大約在800～1400的區域是一段假單胞菌高度同源的序列,并在GenBank上BLAST證明與其它菌高度特異。故我們在此序列區段設計引物并用PrimePrimer 5進行評價,確定后交由上海英俊公司合成。共設計6條LAMP引物（2條內引物，2條外引物，2條促環引物）。引物序列及在基因中的定位見圖1。

圖1 引物序列定位Fig.1 Position of the primer in the sequence

表2 銅綠假單胞菌特異性引物Table 2 Primer of Pseudomonas Aeruginosa

1.5 LAMP反應檢測

總反應體系為 50 μL，其中：10×buffer 2.5 μL（Fermentas），dNTP （10 mmol/L）1 μL（TaKaRa），MgSO4（10 mmol/L）0.5 μL （Fermentas），0.8 mol/L betained，dH2O 14.4 μL（Sigma），Bst polymerase 1 μL(BioLabs)，F3（10 μmol/L）0.2 μL，FIP （10 μmol/L） 1.6 μL，B3（10 μmol/L）0.2μL，BIP（10μmol/L）1.6μL，模板 DNA2μL。

反應于63℃恒溫擴增60 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠，電壓5 V/cm，電泳時間2 h。

1.6 靈敏度測試

模板濃度梯度測試

將模板DNA進行濃度梯度稀釋,然后分別以101、102、103、104、105、106、107、108、109和 1010拷貝作為模板進行等溫擴增，反應結果用電泳觀測。

1.7 干擾菌添加實驗

取3份經證實未污染銅綠假單胞菌的食品樣品（礦泉水、碳酸飲料、奶制品各1份）。經過粉碎后分別接種一定含量的銅綠假單胞菌ATCC 10201菌液的梯度稀釋液（同樣體積的該稀釋液同時進行平板計數）和類似濃度（以吸光度OD值為參照）10倍體積的類鼻狙假單胞菌和10倍體積的惡臭假單胞菌。按照1.2、1.3的方法增菌和提取基因組DNA，按照1.5進行LAMP法檢測。

2 實驗結果

2.1 LAMP引物特異性

肺炎克氏菌LAMP特異性引物組在63℃擴增時特異性最好，實驗用近緣菌株都無假陽性出現，而肺炎克氏菌反應管中都出現白色沉淀，并在電泳中出現特異性泳帶（圖2）。

2.2 檢測靈敏度

通過對一系列梯度稀釋過的模板進行等溫擴增并進行電泳分析，結果見圖3，表明，在對靈敏度檢測中的菌液模板DNA進行檢測，在電泳分析中，發現LAMP反應靈敏度可達到2.2×10 cfu/100 mL。用肉眼進行濁度觀測的靈敏度與電泳檢測相同，也為2.2×10cfu/100mL。

圖2 LAMP引物特異性檢測結果Fig.2 Electrophoresis detecting the specificity of Pseudomonas Aeruginosa with LAMP

圖3 靈敏度檢測電泳結果Fig.3 Sensitivity detection the electrophoresis results

2.3 添加實驗

取3份經證實未污染銅綠假單胞菌的食品樣品（礦泉水、碳酸飲料、奶制品各1份）。經過粉碎后分別接種一定含量的銅綠假單胞菌ATCC 10201菌液的梯度稀釋液（同樣體積的該稀釋液同時進行平板計數）和類似濃度（以吸光度OD值為參照）10倍體積的類鼻狙假單胞菌和10倍體積的惡臭假單胞菌。按照1.3的方法增菌和提取基因組DNA，按照1.5進行LAMP法檢測,陽性結果表示為＋，陰性結果表示為-，結果見表3。

表3 LAMP檢測銅綠假單胞菌添菌試驗結果Table 3 Detection of Pseudomonas Aeruginosa Tim bacteria test results with LAMP

在增菌前，添加綠膿假單胞菌的靈敏度試驗表明，本方法的檢測下限為2.2 cfu/100 g～3.5 cfu/100 g。

通過對3份食品樣品添加一定含量的銅綠假單胞菌和干擾菌（類鼻狙假單胞菌和惡臭假單胞菌）做干擾試驗，經LAMP法檢測，結果表明：該方法可用于復雜基質的實際樣品檢測，且檢測結果用沉淀法和電泳法觀察結果一致。

3 分析討論

LAMP方法的關鍵在于多引物之間無交叉反應，且能成環，在恒溫的條件下，由于選擇的外毒素A（PEA）基因的GC含量比很高，剛性結構很強，不利于LAMP引物的成環，在設計引物的時候盡量將引物的長度縮短，同時在GC比最高的地方設計促環引物和成環引物，加大Bst酶量，使方法得以穩定。試驗表明，本方法檢測靈敏度可達到2.2 cfu/100 g～3.5 cfu/100 g，適用于食品樣品中銅綠假單胞菌的快速檢測。

[1]Moulton P J,Vivian A,Hunter P J,et al.Changes in cultivarspecificity toward pea can result from transfer of plasmid RP4 and other incompatibility group P1 replicons to Pseudomonas syringae pv.pisi[J].Microbiology Dec,1993,139:3149-3155

[2]Khan A A,Cerniglia C E.Detection of Pseudomonas aeruginosa from clinical and environmental samples by amplification of the exotoxin AgeneusingPCR[J].ApplEnvirMicrobiolOct,1994,60:3739-3745

[3]鄭晶,黃曉蓉,趙貴明.SN/T 2099-2008進出口食品中綠膿桿菌檢測方法[S].北京:中國標準出版社,2008:1-9

[4]張宏偉,葉露萌,彭陽思,等.利用環介導等溫擴增技術對沙門氏菌進行檢測[J].食品研究與開發,2009,30(5):115-118

[5]張宏偉,于佳,鄭文杰,等.利用環介導等溫擴增技術對奶粉中阪崎腸桿菌進行檢測[J].食品研究與開發,.2009,30(6):114-117

[6]Takenouchi T,Sakagawa E,Sugawara M.Detection of gyra mutations among 335 Pseudomonas aeruginosa strains isolated in Japan and their susceptibilities to fluoroquinolones antimicrob[J].Agents Chemother.,Feb 1999;43:406-409