比色法測定不同產地黑豆皮中花青素含量

張澤生，林紀偉，2，王志平，於洪建，劉岱琳

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.中國人民武裝警察部隊醫學院生藥教研室，天津 300162；3.鄭州人民醫院藥劑科，河南 鄭州 450012；4.天津市尖峰天然產物研究開發有限公司，天津 300457）

黑豆是我國一種傳統種植的農作物，其具有悠久的食用和藥用歷史，自古以來民間就有用黑大豆補血、活血和烏發養顏的記載。黑豆皮，又稱烏衣，富含大量花青素,主要以飛燕草素、矢車菊素為主[1]，具有抗氧化活性[2]、抑制誘變[3-4]、抗炎[5]、預防癌癥以及延緩衰老等多種保健功效[6]，一直是天然食用添加劑和健康保健食品的原料。

我國是農業大國，從南到北很多省份都種植黑豆，資源豐富，可謂世界各國之首[6]。在我國的北方，如天津市、河北省、山東省都有豐富的黑豆產量，但是由于產地不同，黑豆皮中的功效成分差異較大，因此本文在文獻工作基礎上，利用比色法測定不同產地黑豆皮中花青素的含量，從而進一步控制黑豆皮的質量，為其在食品添加劑和保健食品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設備

1.1.1 材料

黑豆皮原料：黃仁黑豆皮，產自湖北；青仁黑豆皮，產至東北，青扁黑豆皮，產自安徽；市售黑豆皮，產自山東濱州；內蒙黑豆皮，產自內蒙古。所有試驗黑豆皮原料由天津市尖峰天然產物研究開發有限公司提供。

1.1.2 試劑

飛燕草素標準品：挪威Polyphenols公司；無水乙醇、甲醇：均為分析純，天津康科德化工有限公司；鹽酸：天津大茂化工有限公司。

1.1.3 儀器設備

UV-2401PC：日本島津公司；HZQ-QX型電動振蕩機：東聯電子技術開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測波長的確定

用1%鹽酸甲醇溶液配制少量黑豆皮提取液，用UV-2401PC紫外可見分光光度計200 nm～600 nm的范圍內對色素進行掃描，得黑豆皮提取液的吸附光譜圖。同時對標準品溶液在200 nm～600 nm的范圍內進行掃描，得到飛燕草素標準品溶液的吸附光譜圖。

1.2.2 標準曲線的測定

1.2.2.1 標準溶液的配制

精密稱取飛燕草素對照品適量，用1%鹽酸甲醇溶液溶解，定容在100 mL容量瓶中，配制成85.211μg/mL的標準品儲備液，備用。

1.2.2.2 標準曲線的測定

分別精密吸取 2、4、6、8、10 mL 標準品儲備液轉移至100 mL容量瓶中，用1%鹽酸甲醇溶液稀釋并且定容至刻度。在520 nm下測定吸光度，測定標準曲線。

1.2.3 黑豆皮提取物樣品溶液的配制

準確稱取黑豆皮原料5 g加入浸提液浸泡過夜，過濾，測定其體積為V。精密吸取1 mL樣品浸提液，置1000 mL棕色容量瓶中，用1%的鹽酸甲醇定容到刻度，以同批1%鹽酸甲醇溶液作空白，置520 nm處測定其吸收度。花青素含量利用1.2.2.2中的標準曲線進行測定。

1.2.4 黑豆皮中花青素提取條件優化

1.2.4.1 提取溶劑的選擇

準確稱取黑豆皮5 g，共4份，分別置于100 mL三角瓶中，分別加入甲醇、95%乙醇，1%鹽酸甲醇50 mL和1%鹽酸乙醇各50 mL，浸提8 h。按照1.2.3項下配制方法進行樣品制備，測量其吸光度。通過對甲醇、95%乙醇、含有體積比例為1%鹽酸的甲醇溶液和95%乙醇溶液進行考察，確定最佳提取溶劑。

1.2.4.2 提取溶液鹽酸用量的選擇

準確稱取黑豆皮5 g，共5份，分別置于100 mL三角瓶中。分別加入甲醇50 mL、0.5%鹽酸甲醇溶液（體積分數）50 mL、1%鹽酸甲醇溶液（體積分數）50 mL、1.5%鹽酸甲醇溶液（體積分數）50 mL、2%鹽酸甲醇溶液（體積分數）50 mL，浸提8 h。按照1.2.3項下配制方法進行樣品制備測量其吸光度。

1.2.4.3 提取時間的選擇

準確稱取黑豆皮5 g，共6份，分別置于100 mL三角瓶中，精密加入1%鹽酸甲醇50 mL。6份樣品，密封狀態下進行提取，提取時間分別為 1、2、4、6、8、10 h。然后按照1.2.3項下配制方法進行樣品制備，測量其吸光度。

1.2.4.4 料液比的選擇

準確稱取黑豆皮5 g，共5份，分別置于100 mL三角瓶中。分別加入 1%鹽酸甲醇 10、25、50、75、100 mL。密閉狀態下進行浸提8 h。然后按照1.2.3項下配制方法進行樣品制備，測量其吸光度。

1.2.5 加樣回收率的測定

精密稱取已知含量的供試品原料5 g，準確加入與供試品中花青素含量相同的飛燕草素對照品，按照1.2.4中確定的提取方法進行提取，按1.2.3項下確定的方法準確測定，計算平均回收率。

1.3 樣品的含量測定

分別準確稱取不同產地的黑豆皮5 g，按照1.2項下確定的最優提取方法進行提取，按照1.2項下的含量測定方法進行含量測定。每個產地的黑豆皮平行測定3次。

2 試驗結果

2.1 檢測波長的確定

圖1a是黑豆皮提取物在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜，從光譜中可以看出黑豆皮提取物分別在520、362、279、205 nm 處有吸收峰，而 520 nm 為花青素類色素的特征吸收峰。圖1b是標準品飛燕草素在1%鹽酸甲醇溶液中的吸收光譜，從光譜中可以發現其在520、360、280 nm處有吸收峰，綜合分析后，選擇520 nm作為黑豆皮提取物中花青素吸收度的檢測波長。

2.2 標準曲線的測定及方法學考察

2.2.1 標準曲線的測定

按照1.2.2.2項下方法進行測定，結果如圖2所示。

圖1 黑豆皮提取物和標準品的紫外吸收圖譜Fig.1 The UV spectrum of Black Soya Bean Extract and delphinidin

圖2 標準曲線的測定Fig.2 Detection of linear curve

標準曲線為A=0.0943x，（x表示為測試溶液的濃度，單位為 μg/mL），r=0.9996（n＝5），該標準曲線在濃度為1.7μg/mL～8.5μg/mL的范圍內線性良好。

2.2.2 精密度的測定

吸取標準品溶液1 mL，按1.2.2.2項下的方法進行精密度測定，RSD=0.21%（n=6），本方法的精密度良好。

2.2.3 穩定性的測定

吸取供試品溶液 1 mL，分別在 2、4、6、8、10 h 后測定吸光度值。試驗結果表明：在0～10 h內穩定性良好，RSD=0.23%。

2.2.4 重現性試驗

準確稱取同一產地的黑豆皮5份，每份5 g。按1.2.4項下確定的方法進行提取，再按1.2.3項下方法進測定，實驗結果顯示，該方法重現性良好，RSD為0.74%（n=5）。

2.3 黑豆皮中花青素提取條件優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

不同溶劑的浸提結果見表1。

表1 不同溶劑的浸提結果Table 1 Extraction using different solution

表1測試結果顯示采用1%的鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑時，吸光度最高，說明具有很好的提取效果。因此本試驗采用1%的鹽酸甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取溶劑酸度選擇

不同鹽酸濃度的浸提結果見表2。

表2 不同鹽酸濃度的浸提結果Table 2 Extraction using different content HCl

測試結果如表2，在相同提取時間條件下，隨著鹽酸濃度的增加，測試溶液的吸光度值也在增高。說明酸度的增加會提高提取收率。但是從1%～2.5%的酸度變化，提取溶液的吸光度值增加并不明顯，因此確定提取溶液鹽酸濃度為1%。

2.3.3 提取時間的選擇

不同時間的浸提結果見表3。

表3 不同時間的浸提結果Table 3 Extraction using different time

如表3所示，浸提時間達到8 h時，吸光度值達到最高，而且隨著提取時間的增加，吸光度值達到穩定。因而確定浸提時間為8 h。

2.3.4 料液比的選擇

不同料液比的浸提結果見表4。

表4 不同料液比的浸提結果Table 4 Extraction using different volume solution

通過對不同料液比的考察，結果如表4所示，料液比為1∶10時，吸光度值達到最高，因而確定最佳料液比為 1∶10。

2.4 加樣回收率的測定

按照1.2.5項下確定的方法準確測定，平均回收率為 98.34%，RSD=2.32%（n=5）。

2.5 不同產地黑豆皮中花青素的含量

按照1.2.4項下確定的提取方法進行含量測定，結果如表5所示。分析結果如表5所示，市售的黑豆皮其花青素含量相對較低，而安徽產的青扁黑豆皮花青素含量相對較高。

表5 不同產地黑豆皮中花青素的含量測定Table 5 Detection of anthocyanidin of black soybean from different varied area

3 小結與結論

1）對國內不同產地的黑豆皮原料進行了花青素含量測定，測試結果顯示不同產地的黑豆皮原料中花青素的含量差異較大，品種之間以安徽產的青扁黑豆皮花青素含量相對較高，雖然市售黑豆皮的含量相對較低。

2）本文利用紫外分光光度法測定不同區域的黑豆皮中花青素的含量，該方法簡便，快速，結果準確，可靠，適于黑豆皮中花青素成分的質量控制。

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