β-葡萄糖苷酶高產菌株篩選、誘變及其發酵的研究

潘艷，張益波，郭志敏，王詩雨，邢慧萌，林風，滕利榮，侯阿澧

（吉林大學生命科學學院，吉林 長春 130012）

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21;β-D-Glucosidase）也叫纖維二糖酶，在不同生物中由多種同源酶組成，作用是從非還原性末端催化水解β-葡萄糖苷鍵釋放β-D-葡萄糖。β-葡萄糖苷酶在不同的生物體內和生物技術應用中都有重要的作用，這包括對生物質的降解[1]；利用纖維秸稈類生產乙醇[2]；作為一種重要風味酶，它能作用于茶葉、葡萄酒以及果汁中的風味前體物質，釋放出風味成分，起到增香作用[3]；也是合成重要的糖配體[4]等。在纖維素酶的糖化過程中，纖維二糖對內切纖維素酶和外切纖維素酶有很強的抑制作用，添加過量β-葡萄糖苷酶可以減緩這種競爭性抑制作用。

本文從玉米秸稈天然腐爛的腐土中篩選得到了一株能生產高效胞外β-葡萄糖苷酶的菌株。對此菌株進行紫外、化學、以及化學和紫外的復合誘變[5]，得到的UV-4-DES6具有生長速度快，利用工農業廢料產酶高的特性，可能是解決β-葡萄糖苷酶工業化發酵生產的優良菌株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

所有用到的化學藥品均購買于上海生工生物工程公司，秸稈的腐土采集于常年堆積的秸稈堆下方。

1.1.2 工農業廢料

工農業廢渣即麥麩（WB）、氣爆玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）、酒糟（DDG）、玉米漿（CSL）、豆粉（SM）或豆餅粉（BCP）都在當地獲得，將這些原料烘干并進一步粉碎，過0.355 mm（45目）篩備用。

1.1.3 儀器設備

SKP-01電熱恒溫培養箱、SKPC-01電熱恒溫鼓風干燥箱：湖北省黃石市醫療器械廠；VS-1300-U超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；752紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；MDF-492超低溫電冰箱：日本三洋公司；可調式微量取液器：德國Eppendorf公司等。

1.1.4 培養基

纖維二糖誘導培養基：每升中含有酵母2.5 g，纖維二糖 2.5 g，蛋白胨 2.5 g，（NH4）2SO4，1 g；KH2PO4，0.5 g和MgSO40.2 g。

篩選培養基：在誘導培養基中加入七葉苷水合物1 g；瓊脂粉20 g；滅菌后加入濾菌后的檸檬酸鐵銨溶液至三價鐵終濃度為0.3%[6]。

PDA培養基：用于菌種培養和活化等，加200g土豆的煮出濾汁，葡萄糖20g，加20g瓊脂，補水至1000mL。

產酶培養基：秸稈粉20 g/L，蛋白胨5 g/L，Mandels營養鹽[7][常量元素液（10×），含有（NH4）2SO43.5 g/L，KH2PO42 g/L，（H2N）2CO 0.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl20.3 g/L；微量元素溶液（1000×）含有 FeSO4·7H2O 5 g/L，MnSO4·H2O 1.6 g/L，ZnSO4·7H2O 1.4 g/L，CoCl22 g/L]。121℃下高壓蒸汽滅菌30 min備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

篩選方案[8]如下：準確稱取腐土樣本0.1 g加入已消毒的玻璃珠，用100 mL無菌水溶解，搖床振搖制備樣品懸液，然后加入到纖維二糖誘導培養基，30℃、150 r/min條件下搖床培養5 d。整體離心并做梯度稀釋，取102倍～107倍體積稀釋液涂布到篩選培養基平板，觀察并挑選出幾個周圍帶有較大黑圈且黑圈與菌落直徑比值較大的菌落，每株菌單獨接種于纖維二糖誘導培養基，30℃搖床人工培養3d后12000r/min、4℃離心10 min，取上清測定β-葡萄糖苷酶活性，選取酶活力高的菌株保存。

1.2.2 誘變過程

篩選得到的菌株→制備孢子懸液→UV誘變→涂布篩選平板初篩→保存菌株→DES誘變→涂布篩選平板初篩→產酶復篩→獲得高產菌株→PDA斜面保存。

1.2.3 菌種誘變

1.2.3.1 制備孢子懸液

取培養3 d菌的PDA斜面4支～5支，用無菌生理鹽水將孢子洗下，并裝入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，充分振搖30 min；將上述菌液離心（3000 r/min，離心15 min），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次～3次，最后制成孢子懸液；用顯微鏡直接計數法計數，調整細胞濃度為108個/mL。

1.2.3.2 紫外誘變[9]

將紫外線燈開關打開預熱約20 min，紫外等照射功率為15 W，距離為30 cm。將盛有菌懸液的套平皿置于磁力攪拌器上，紫外線燈下分別攪拌照射30、60、120、180、240、300、360、420、480 和 540 s。取 100 μL 稀釋 10-4、10-5、10-6、10-7的菌液用涂布棒涂布均勻，同時涂布等量稀釋的原孢子懸液做對照，置30℃培養24 h，進行菌落計數，計算致死率：

1.2.3.3 硫酸二乙酯誘變

使用1.0%DES，于26℃，150 r/min搖床中分別振蕩 20、40、60、80、100、120 和 160 min，進行誘變。加入500 μL 25%硫代硫酸鈉終止反應，12000 r/min離心10 min，去上清，取1 mL PBS緩沖液洗滌1次離心，加1 mL磷酸緩沖液重懸沉淀后每管取出100 μL稀釋10倍。取稀釋液100 μL涂平板。30℃倒置培養24 h，數菌落數，涂篩選平板篩選。

1.2.4 菌株篩選

將誘變得到的菌株進行初篩和復篩，初篩的過程采用篩選培養基進行，在30℃倒置培養24 h后選擇透明圈和菌落直徑比較大的保存；復篩的過程采用纖維二糖誘導培養基進行培養，在30℃，120 r/min培養3 d后，10000 g離心10 min，選擇上清測定β-葡萄糖苷酶活力。

1.2.5 測定酶活力[10]

培養結束后取樣品懸液12000×g離心5 min，留取上清測定酶活力。

β-葡萄糖苷酶活性測定方法：取上清液適當稀釋的酶液0.5 mL，加入2 mL 0.5%的水楊素（乙酸鈉緩沖液，pH 0.5，100 mmol/L）37℃反應 30 min，加入 2.5 mL DNS后沸水浴5 min，混勻，靜止10 min，540 nm測定吸光度。

一個酶活性單位（U）定義為實驗條件下每分鐘從底物中釋放1 μmol還原糖所消耗的酶的量。

2 結果與討論

2.1 分離和鑒定

從腐敗土樣中挑選出幾個在篩選培養基上長出較大黑圈的單菌落。經過PDA的劃線培養純化后，得到10株在篩選平板上能夠產生較大透明圈比值的菌株分別命名為（zyb 1、zyb 2、zyb 3、zyb 4、zyb 5、zyb 6、zyb 7、zyb 8、zyb 9 和 zyb 10），將這 10 株菌分別接種在纖維二糖誘導培養基中培養，均表現出良好的生產胞外β-葡萄糖苷酶性能。在誘導培養基上生長的菌株離心測定上清液中的β-葡萄糖苷酶活力分別為：0.315、0.513、0.419、0.673、0.821、0.801、0.327、0.568、0.596、0.415 U/mL。選取β-葡萄糖苷酶活最高的菌株及zyb 5進行誘變選育。

2.2 誘變結果

2.2.1 紫外誘變

紫外誘變是一種常用的物理誘變手段。微生物在經過紫外線照射后，會受到不同程度的損傷，導致DNA或者是染色體發生畸形，從而導致生物性狀的改變。在紫外誘變過程中，要了解菌株對紫外線的敏感性，需要進行誘變致死曲線的測定，根據致死曲線來確定最佳的紫外誘變時間。圖1為紫外誘變過程中隨著照射紫外時間延長得到的致死率曲線。

圖1 紫外誘變致死率曲線Fig.1 Fatality rate after UV mutataion

根據文獻報道曲線中達到最佳誘變效果的致死率應該在70%～80%[11-12]，在此過程中選擇的紫外誘變時間為300 s，此時致死率達到了77%，后面的實驗選擇紫外誘變的時間為300 s。

按照紫外誘變的方案，對得到的zyb 5菌株進行紫外誘變選育，經過初篩和復篩得到5株活力較高的菌株，分別命名為 UV-1，UV-2，UV-3，UV-4和 UV-5。在纖維二糖誘導產酶培養基中，它們發酵上清產酶活力分別為：1.21、1.05、1.18、1.38 和 1.25 U/mL。根據酶活力作為指標的篩選結果，DES誘變的出發菌株選擇UV-4菌株。

2.2.2 硫酸二乙酯誘變

硫酸二乙酯是常用的化學誘變劑，主要的原理是導致堿基對的轉換、缺失和易位等。本實驗在紫外誘變高產菌株的基礎上，對UV-4菌株的孢子懸液按照不同的處理時間進行處理。得到UV-4菌株在硫酸二乙酯誘變劑存在隨著時間變化的致死率曲線見圖2。

圖2 硫酸二乙酯誘變致死率曲線Fig.2 Fatality rate after DES mutataion

從圖2中可以看出，當使用DES處理時間達到100 min后，UV-4菌株的致死率達到了89%，時間延長后致死率太大，得到的菌株很難在進行初篩和復篩。考慮到突變較多又容易篩選，所以選擇DES的誘變時間為100 min。按照DES誘變的方案，對得到的UV-4菌株進行誘變選育，經過初篩和復篩得到10株活力較高的菌株，分別命名為UV-4-DES1，UV-4-DES2，UV-4-DES3，UV-4-DES4，UV-4-DES5 和 UV-4-DES6。在纖維二糖誘導產酶培養基中，它們發酵上清產酶活力分別為：2.15、2.01、2.21、2.32、2.04、2.35U/mL。根據酶活力作為指標的篩選結果，DES誘變的出發菌株選擇UV-4-DES6菌株。

2.3 UV-4-DES6菌株的發酵生產

纖維素酶尤其是β-葡萄糖苷酶的成本非常昂貴，為了降低生產成本。本研究在篩選誘變高產菌株的基礎上，使用工農業廢料包括麥麩（WB）、氣爆玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）、酒糟（DDG）、玉米漿（CSL）、豆粉（SM）或豆餅粉（BCP）替代誘導培養基中的纖維二糖，以發酵培養基為基準加入量，將工農業廢料作為UV-4-DES6菌株發酵的碳源和氮源，30℃，120 r/min發酵3 d后，離心取上清測定酶活力。其中麥麩(WB)、處理過的玉米秸稈（TCS）、未處理的玉米秸稈（UTCS）和小麥秸稈（WS）被用作碳源，玉米漿（CSL），酒糟（DDG），豆粉（SM）和豆餅粉（BCP）被用作氮源，對誘變菌株的β-葡萄糖苷酶的生產進行培養基活性的選擇。表1記錄了所得結果，可以看出，在使用工農業廢料作為生產β-葡萄糖苷酶的培養基而言，大部分具有比纖維二糖作為底物時更高的產酶能力。這也說明了誘變的UV-4-DES6菌株同樣具有其它種纖維素酶生產的能力，可以完全降解這些工農業廢料。就提高β-葡萄糖苷酶活性來說，處理過的玉米秸稈（TCS）是最好的碳源。這可歸因于其前處理過程及組成成分。經氣爆前處理后0.6%的葡萄糖（TCS）及疏松的結構組成更適合于β-葡萄糖苷酶的產生。來自不同工農業廢料的氮源對β-葡萄糖苷酶產生的影響極為顯著。加入豆粉后所得β-葡萄糖苷酶活性為2.738 U/mL，比纖維二糖作為碳源時酶活力增加了0.386 U/mL。可能是因為豆粉（SM）富含微量元素和維生素等物質。用工農業廢料作為碳源和氮源生產β-葡萄糖苷酶不但可以降低產酶的成本，也減少環境污染。

表1 碳源和氮源對UV-4-DES6菌株所產β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 1 Effect of carbon and nitrogen sources on BGL activity of UV-4-DES6

3 結論

本研究從常年堆積玉米秸稈的腐土中分離得到一株能生產β-葡萄糖苷酶的菌株zyb 5，此菌株具有較強的生長繁殖能力和產酶能力。對zyb 5進行紫外和化學誘變，得到菌株UV-4-DES6。在30℃，150r/min搖床發酵4 d后，產酶活力由出發菌株的0.821 U/mL上升到2.352 U/mL，提高了2.8倍。在此基礎上采用工農業廢料作為生產β-葡萄糖苷酶的培養基，經過優化β-葡萄糖苷酶活力升高了0.386U/mL，達到了2.738U/mL。與文獻中已報道的其它菌類Monascus purpureus（2.04U/mL）[13],Penicillium echinulatum（0.31U/mL）[14],and Trichoderm-areesei（0.26 U/mL）[15]相比，本菌株的β-葡萄糖苷酶的酶活較高，而且產酶效率高，產酶較快。這種來源于腐土后經過誘變的UV-4-DES6菌株具有很強的工業化應用價值。

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