伊犁地區乳品中乳酸菌的分離及鑒定

尚天翠，劉影，衛剛

（1.伊犁師范學院化學與生物科學學院，新疆 伊寧 835000；2.新疆伊寧衛生學校專業基礎學科，新疆 伊寧 835000）

乳酸細菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸而多數不能分解蛋白質的革蘭氏陽性細菌的統稱。這類細菌在自然界分布極為廣泛，與人類生活有著密切的關聯。多數有益乳酸菌在其發酵食品及產物中不形成任何毒素或有毒產物，產生乳酸及一些芳香物質而直接提高發酵食品的營養價值和可口性。

伊犁哈薩克自治州地區制作乳酸發酵奶食品的資源非常豐富，并且有傳統的制作經驗。該區的少數民族，如哈薩克族和維吾爾族以牛乳、羊乳、馬乳和駱駝乳等為原料，采用傳統工藝加工各種發酵乳制品，產品的加工方法雖然比較簡單，但風味純真獨特，這與該區特殊的自然環境以及其中分布的微生物種群有著密切關系，因此，探明這一地區乳酸菌的種類十分必要。本文對伊犁地區的乳及乳制品樣品進行了采集，并進行了乳酸菌的分離、鑒定和詳細生物學特性的研究，旨在為開發利用這一地區特有的乳酸菌資源，促進該區乳制品工業的發展提供參考，同時，也為微生物生態學積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源

2009年4月采集伊犁哈薩卡自治州伊犁昭蘇牧場酸駝奶（編號ST），伊犁伊寧縣駝奶（編號TO），伊犁果子溝酸牛奶（編號SN）和伊寧市牛奶（編號NO）各1份。樣品存放于滅菌采樣瓶中，置于冰盒中4℃存放，直至運回實驗室。

1.1.2 標準菌株

德氏乳桿菌保加利亞亞種（L.delbrueckii subsp.bulgaricus.CGMCC 1.1863）、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.1actis subsp.lactis.CGMCC 1.1936）、腸膜明串珠菌葡聚糖 亞 種 （L.mesentaroids subsp.dextranicum.CGMCC 1.17）：購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養基

MRS培養基、BCP培養基、LB培養基按文獻[1-2]的方法配制；而其他生理生化試驗和糖類發酵試驗用培養基和試劑等均按文獻[2-5]的方法配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的計數及分離

將乳品經過溫度、pH測定后，進行乳酸菌的分離和純化：將乳品用滅菌生理鹽水10倍遞增稀釋至10-4、10-5兩個稀釋度。乳酸菌計數采用傾注法[6]。

將乳品10-4、10-5稀釋液用滅菌接種環劃線接種于MRS瓊脂培養基上培養24 h～72 h，然后挑取有透明環的單個菌落，接種到MRS瓊脂培養基和BCP培養基上純培養，純化后再接種到MRS瓊脂培養基和BCP培養基培養后，置4℃冰箱中保存、備用[7]。

1.2.2 菌株的形態、染色特性及菌落特性觀察

觀察培養后的乳酸菌的形態和培養特征并記錄。

取各種單菌落涂片，用革蘭氏染色法染色，在顯微鏡下觀察，記錄其形態特征，并進行顯微照相。

1.2.3 乳酸菌的鑒定及其生物學特性的研究

根據文獻[6，8-9]，革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、聯苯胺反應試驗等為陰性，在MRS平板培養基上菌落周圍形成明顯的透明環的所有分離菌，均初步鑒定為乳酸菌（桿菌或球菌）。在確定為乳酸菌的前提下，進一步進行明膠液化試驗、吲哚試驗、產生硫化氫試驗、不同pH培養試驗、不同溫度培養試驗、耐鹽性試驗、美藍還原試驗、糖發酵試驗等試驗，將乳酸菌屬分離菌株鑒定到種。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的計數和分離

伊犁地區乳品中乳酸菌的計數與分離結果見表1。

表1 乳酸菌的計數和分離Table 1 Counting and isolation of lactic acid bacteria

從表1可以看出，乳酸菌數量在6.48×107mL-1～1.12×109mL-1之間，并且4種乳樣中共分離出10株乳酸菌，其中桿菌4株、球菌4株、明串珠菌2株。并且從表中我們還可以看出，酸駝奶和酸牛奶中乳酸菌的種類明顯高于其他樣品。

2.2 乳酸菌菌株的形態、菌落特性及染色特性

2.2.1 乳酸菌菌株的形態及菌落特性

本研究分離的菌株在MRS培養基上生長48 h后，菌落外周形成大小不同的透明區，而在BCP培養基上生長后，菌落周圍的顏色由藍紫色變成黃色[5]。從培養好的平板中，挑取10個不同的單菌落，逐個編號，根據菌落識別要點，識別乳酸菌的培養特征結果見表2。

表2 未知乳酸菌菌落的形態特征Table 2 Morphological characteristics of unknow lactic acid bacteria

從表2可以看出，分離的桿菌在MRS培養基上形成圓形光滑、比較厚、大小0.5 mm～3 mm左右的乳白色、表面光滑、邊緣整齊、透明隆起的菌落，如ST3，SN2，NO2，TO1。

分離的球菌在MRS培養基上形成圓形光滑、比較薄、大小0.5 mm～2 mm左右的乳白色、表面光滑、邊緣整齊、透明扁平的菌落，如 ST1，ST2，ST4，SN1，NO1，TO2。

2.2.2 乳酸菌菌株的染色特性

分離的菌株經革蘭氏染色，用E221LED型光學顯微鏡放大40倍觀察結果為：呈革蘭氏染色陽性，有單個、成對或鏈狀排列的短或長桿菌以及單個、成對或鏈狀排列的球狀菌或桿狀菌，如圖1。

2.3 乳桿菌屬種（Lactobacillus）的鑒定結果及其生物學特性

乳桿菌屬種的鑒定結果見表3、表4。

圖1 各種乳酸菌的形態觀察Fig.1 Morphologic observation of different lactic acid bacteria

表3 乳酸菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

表4 乳酸菌糖發酵試驗鑒定結果Table 4 Fermentation characteristics of lactic acid bacteria

表3、表4中所列的4株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、聯苯胺試驗、吲哚試驗、H2S產生試驗和明膠液化試驗中呈陰性，均不運動，能在pH為4.5中生長的桿狀菌株鑒定為乳桿菌屬的細菌。被鑒定的4株菌的共同特點是都能在10℃和45℃條件下生長，不產生氨的同型發酵型菌株。菌株ST3、SN2、NO2、TO1能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖等單糖，也能發酵蔗糖、纖維二糖、果糖等雙糖，能利用松三糖，不能發酵鼠李糖，乳酸旋光性為DL，因此為干酪乳桿菌假植物亞種（L.casei subsp.Plantaman）。以上4株菌在45℃均能生長，都有耐熱性，不能耐受pH6.5的NaCl，但對pH9.6的NaOH有耐受性，可被0.1%美藍還原。

2.4 球形乳酸菌屬的鑒定結果及生物學特性

上述分離到的6株球菌，進行了硝酸鹽還原試驗、硫化氫產生試驗、聯苯胺試驗、明膠液化等生理生化反應試驗，最終將6株菌株歸屬于下列3個屬，見表3。

2.4.1 腸球菌屬種（Enterococcus）的鑒定結果及其生物學特性

表3、表4中，ST1，SN1菌株在過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、聯苯胺試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗均為陰性，在10℃和45℃都生長的革蘭氏陽性球狀菌，鑒定為腸球菌屬的細菌。這兩株菌均能在pH9.6和6.5%NaCl環境中生長，均能還原0.1%美藍，能水解精氨酸，將能分解木糖、棉子糖、蜜二糖，對阿拉伯糖有一定分解能力的ST1菌株鑒定為雞腸球菌（E.gallins.rum）；將能利用檸檬酸鹽，而不利用鼠李糖、山梨醇的SN1菌株鑒定為屎腸球菌（E.faecium）。

2.4.2 乳球菌屬種（Lactococcus）的鑒定結果及其生物學特性

在表3、表4中，ST2，NO1菌株在10℃和40℃都生長，在45℃不生長，不能在6.5%NaCl環境中生長，能還原0.1%美藍，不運動，能耐受pH9.6的堿性環境，精氨酸不產氨，能分解蔗糖和麥芽糖，不能利用蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨醇，因此將這兩菌株鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubspcremoris）。

2.4.3 明串珠菌屬種（Leuconostoc）的鑒定結果及其生物學特性

表3、表4中所列的ST4，TO2菌株，革蘭氏染色為陽性，球狀成對或鏈狀排列，在過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、聯苯胺試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗、產氨試驗、乙酰甲基甲醇（V.P.）試驗、檸檬酸鹽利用試驗均為陰性，發酵葡萄糖既產酸又產氣，可液化明膠，不水解精氨酸，不產生吲哚和硫化氫，在25、40、45℃均能生長但在10℃時不生長，能利用多種單糖、雙糖、多糖，但對鼠李糖、棉子糖、松三糖和蜜二糖的利用能力較弱，因此這兩菌株暫定為腸膜明串珠菌腸膜亞種（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）。

3 結論與討論

對伊犁地區牧民家庭中采集的乳品中的乳酸菌進行了分離和鑒定。結果表明：從4份樣品中共分離到乳酸菌10株，并進行了種的鑒定，分到干酪乳桿菌假植物亞種（L.casei subsp.Plantaman）4 株、雞腸球菌（E.gallins.rum）1 株、屎腸球菌（E.faecium）1 株、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactis subsp.cremoris）2株、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）2株。

所分離菌株均為中溫菌，即10℃生長，40℃生長良好，其中 ST1、ST3、ST4、NO2、TO1、TO2、SN1、SN2 等8株在10℃和45℃培養均能良好生長。從生長溫度結果看，乳球菌、腸球菌在10℃～45℃范圍內具有較強的適應性，而明串珠菌在20℃～30℃（或稱室溫）環境下具有良好的生長特性。這表明，所分離菌株具有適應于該地區多變的氣候和室內外溫度等環境的能力。而且該地區乳酸菌微生態關系也較多樣化，有單生，也有共生、互生和拮抗等現象。如：ST1，ST2，ST3與ST4、SN1與SN2、NO1與NO2、TO1與TO2為共生菌。乳酸菌微生態關系的探明對于不同菌株的功效解析有一定意義。如果將本項分離菌株合理組合，會得到具有獨特風味的更好的新的乳制品。本次研究主要采用乳酸菌生理生化指標特性的表型鑒定方法，所以，鑒定試驗結果個別菌株有些項目與標準不符。因此，更詳細的歸屬研究分析有待結合分子生物學方法進一步進行。

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