諾麗發(fā)酵果汁抗氧化實驗研究

李煦照，于純淼，陳佳，劉樹民，*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

諾麗（Morinda citrigolia L.，Noni），也稱海巴戟，屬茜草科植物，是一種發(fā)源于南太平洋島嶼的熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木，富含多種營養(yǎng)成分。在太平洋群島，波利尼西亞人和庫克人認(rèn)為他們的祖先應(yīng)用海巴戟治療疾病有2000多年的歷史，主要用于抗感染和治療慢性疾病，是波利尼西亞人和庫克人最主要的藥用植物之一，在民間廣為應(yīng)用[1]，傳統(tǒng)用于抗衰老、糖尿病、口臭、口腔潰瘍、痔瘡、腫瘤、結(jié)核病、魚肉中毒和高血壓等。本試驗研究發(fā)酵諾麗果汁對溴代苯所致小鼠急性肝損傷的抗氧化功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

諾麗果汁：購于海口，自然發(fā)酵3個月，用蒸餾水配成所需濃度；溴代苯：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純（臨用前用食用油配成適宜濃度的供試液）；MDA、SOD、GSH-Px測定試劑盒及考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗動物

昆明小鼠，雄性，體重18 g～22 g，清潔級，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號：SCXK黑2008004。

1.1.3 主要儀器

KDC-160HR高速冷凍離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；756紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；XHF-1內(nèi)切式組織勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 前期給藥

選18 g～22 g健康成年昆明小鼠，雄性，隨機分成空白對照組、模型對照組和受試樣品高、中、低劑量組，每組l0只。按成人體重60 kg計，受試樣品每次用量為50 mL，1 d 2次，相當(dāng)于1.66 mL/（d·kg）。試驗中按成人推薦用量的5、10、20倍，設(shè)高、中、低劑量組。濃度分別為0.21、0.42、0.84 mL/mL，以蒸餾水配制。經(jīng)口給藥，灌胃量為0.2 mL/10 g。30 d后取血測抗氧化酶活力（GSH－Px、SOD）。空白對照組經(jīng)口給予同體積溶劑。

1.2.2 造模方法

按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[2]，給藥30 d后，取血測抗氧化酶活力，此后動物饑餓過夜，第2天給予受試樣品或溶劑1 h后，除空白對照組外，各組小鼠經(jīng)口給護溴代苯油（3 mmol/L），灌胃量0.1 mL/10 g。20 h后處死動物，取肝組織測過氧化脂質(zhì)含量（MDA）和抗氧化酶活力（GSH-Px、SOD）。

1.2.3 樣品制備

1.2.3.1 血清樣品

取血0.5 mL，4000 r/min離心10 min，取血清備用。

1.2.3.2 全血樣品

取血20 μL加入到2.48 mL蒸餾水中，充分振搖，使之全部溶血，4 h內(nèi)測定酶活力。

1.2.3.3 肝組織上清液

動物處死后，立即取出所需肝臟，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎片，稱取適量組織，制成10%組織勻漿，操作在冰浴中進行。勻漿以4000r/min，4℃離心10min，取上清液備用。

1.2.4 各指標(biāo)測定

本試驗測定全血GSH-Px酶活力，血清總SOD活力，肝組織MDA含量，肝組織GSH-Px酶和總SOD活力。

1.2.4.1 GSH-Px活力測定

采用二硫代二硝基苯甲酸法(DTNB法)。

1）取1∶124全血0.2 mL測全血GSH-Px酶活力

全血GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20μmol/L）×5×（1+124）/（1+49）

2）取0.25%組織勻漿0.2 mL測組織中GSH-Px酶活力

組織中GSH-Px酶活力=（非酶管OD值－酶管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（20μmol/L）×5/反應(yīng)時間/（取樣量×蛋白含量）

1.2.4.2 SOD活力測定

采用黃漂吟氧化酶法。

1）取血清20 μL測定總SOD活力

總SOD活力/（U/mL）=（對照管吸光度－測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)

2）取1%肝組織勻漿25 μL測定總SOD活力

組織勻漿中SOD活力/（U/mgprot）=（對照管吸光度－測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應(yīng)液總體積/取樣量（mL）/組織中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.3 MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。

取10%肝勻漿0.1 mL測定MDA含量。

組織中MDA含量/（nmol/mgprot）=（測定管吸光度－測定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）/組織中蛋白含量（mgprot/mL）

1.2.4.4 蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭法

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵諾麗果汁對小鼠谷胱甘肽過氧化物酶活力的影響

發(fā)酵諾麗果汁高、中、低三劑量組中全血谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力均高于空白對照組，但無顯著性差異，結(jié)果見表1。

肝損傷實驗中，發(fā)酵諾麗果汁高、中、低三劑量組及空白對照組中肝組織谷胱甘肽過氧化物酶活力均低于模型對照組，但無顯著性差異。高、中、低三組中，隨著劑量的增加，谷胱甘肽過氧化物酶活力反而下降，結(jié)果見表2。

2.2 發(fā)酵諾麗果汁對小鼠超氧化物歧化酶活力的影響

發(fā)酵諾麗果汁中、低三劑量組血清超氧化物歧化酶活力均高于空白對照組，中劑量組顯著高于空白對照組（P<0.05），高劑量組低于空白對照組，結(jié)果見表1。

表1 發(fā)酵諾麗果汁對小鼠抗氧化酶活力的影響(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

表1 發(fā)酵諾麗果汁對小鼠抗氧化酶活力的影響(血液)（，n=10）Table 1 Fermented Noni Juice on the activity of antioxidant enzymes in mice（blood）

注：*與空白組對比P<0.05。

組別GSH-Px/（μmol/L）SOD/（U/mL）空白對照組 221.76±72.60 138.10±12.08低劑量組 245.72±80.74 138.94±22.24中劑量組 268.32±68.36 170.28±10.49*高劑量組 244.83±83.25 135.41±12.46

表2 發(fā)酵諾麗果汁對肝損傷小鼠過氧化脂質(zhì)含量和抗氧化酶活力的影響(肝組織)Table 2 Fermented Noni Juice on lipid peroxide content and the activity of antioxidant enzymes in liver injury mice（liver tissue）

肝損傷實驗中，發(fā)酵諾麗果汁低劑量組中肝組織超氧化物歧化酶活力高于模型對照組，但無顯著性差異，高、中及空白對照組均低于模型對照組，結(jié)果見表2。

2.3 發(fā)酵諾麗果汁對肝損傷小鼠過氧化脂質(zhì)（MDA）含量的影響

模型對照組肝組織中過氧化脂質(zhì)（MDA）含量顯著高于空白對照組（P<0.05），中劑量組肝組織中過氧化脂質(zhì)（MDA）含量顯著低于模型對照組（P<0.05），高、低劑量組組織中過氧化脂質(zhì)（MDA）含量則高于模型對照組，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

在正常情況下，機體內(nèi)有一定數(shù)量的自由基，機體內(nèi)的SOD、GSH-Px等酶可以有效的清除多余的自由基，使體內(nèi)的氧化與還原反應(yīng)保持著平衡狀態(tài)。一旦體內(nèi)的氧自由基大量產(chǎn)生或抗氧化系統(tǒng)功能減弱，都會導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷。本實驗肝組織中空白對照組與模型組MDA含量有顯著性差異，造成了過氧化損傷模型。

肝組織中，GSH-Px活力隨著發(fā)酵諾麗果汁劑量的增加而降低，總體呈逐漸下降趨勢，提示發(fā)酵諾麗果汁具有非常強的抗自由基作用，基本能消除自由基對肝組織的傷害，對肝組織具有一定保護作用[3]。而各劑量組肝組織中的SOD活性無明顯變化，推測可能與其在試驗中活性代償性反應(yīng)有關(guān)[4]。

各劑量組血中GSH-Px與SOD活力均高于空白對照組，提示發(fā)酵諾麗果汁對于未造成過氧化的動物具有增高抗氧化酶活力作用。

實驗結(jié)果表明發(fā)酵諾麗果汁可以通過減少膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，提高機體清除氧自由基能力，強化抗氧化解毒系統(tǒng)，對肝細(xì)胞氧化損傷起到一定保護作用。

[1]彭勇,肖偉,劉勇,等.世界藥用植物新寵——海巴戟果[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊,2007,22(3):93-96

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S].2003:43

[3]馬文濤,楊來啟,楊喜民,等.維生素C對應(yīng)激大鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶含量的影響[J].中國心理衛(wèi)生雜志,2002,16(12):809-810

[4]Gaohua,Zhou yawei.Anti-lipid peroxidation and protection of liver mitochondri against injuries by picrosideⅡ[J].World J Gastroenterol,2005,11(24):3671