茶葉浸提液對肉制品中亞硝酸鹽的清除效應

郝教敏，梁海燕，汪建國，楊華，馬儷珍

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.新鄉醫學院公共衛生學系,河南 新鄉 453003;3.天津農學院食品系，天津 300384）

亞硝酸鹽因其在食品加工過程中的發色、增香、調味作用，以及對肉毒梭狀芽胞桿菌的抑制作用，而成為肉類食品加工過程中允許限量使用的食品添加劑[1]。但肉制品中亞硝酸鹽殘留超過一定量，其亞硝酸根極易與肉制品中蛋白質分解產物胺類物質、或在人體胃腸酸性環境下蛋白質分解產物二級胺類發生反應生成亞硝胺[2]，從而危害人體健康。世界衛生組織規定亞硝酸鈉/鉀每日允許攝入量為≤0.2 mg/kg體重，我國食品添加劑使用衛生標準（GB 2760-2007）[3]規定：在肉類制品和肉類罐頭中亞硝酸鹽的最大使用量為0.15 g/kg，殘留量以亞硝酸鈉計，肉類罐頭不得超過50 mg/kg，肉制品不得超過30 mg/kg。據資料表明[4-5]，上市的各類熟肉制品的合格率平均僅為60.4%～87.0%。如何減少肉制品中亞硝酸鹽的殘留量問題[6]，尤其添加天然無毒的物質清除亞硝酸鹽[7]已成為當今一個熱門研究課題。

我國食品添加劑產業結構中能替代亞硝酸鹽的物質較少，尤其是天然無公害替代物，目前列入國標GB2760的僅有甘草抗氧化物、茶多酚、植酸和磷脂等少數替代物。研究表明，一些含有VC、多酚、黃酮類化合物、多糖等物質的果蔬有降低或消除肉制品中亞硝酸鹽殘留的功效[8-10]；在肉制品生產中添加茶多酚（TP）可降低亞硝酸鹽用量而發色能力不變[11]；在pH3.37模擬胃液條件下，綠茶對NaNO2的消除率隨茶相對劑量增加呈指數曲線上升[12]；各種茶葉均有抑制阻斷亞硝酸鹽致突變合成亞硝胺的作用[13]。本研究擬在探討茶葉浸提液清除肉制品中亞硝酸鹽的最佳條件，為安全肉制品生產提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

新鮮茶葉（綠茶）、梅林牌午餐肉、雙匯王中王火腿腸：購于山西省太谷縣家家利超市。

1.1.2 試劑

30%乙酸、95%乙醇、0.4%對氨基苯磺酸溶液、0.2%鹽酸萘乙二胺、6 mol/L鹽酸溶液、0.5 mol/L氫氧化鈉溶液、5μg/mL標準亞硝酸鈉溶液、硫酸鋅、氯化胺緩沖液均為分析純配制。

1.1.3 設備

BS-224S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：金壇市新航儀器廠；WFJ2100型可見光分光光度計：上海棱譜儀器儀表有限公司；CN61M/BY01-1.2自動數顯平衡離心機：西化儀（北京）科技有限公司；pH211型精密酸度計：上海雷茲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶葉浸提液的制備

溶劑提取法[14]。

新鮮綠茶葉→浸于95%乙醇→水浴浸提→紗布過濾→靜置→離心30 min→取上清液備用

稱取150 g新鮮茶葉浸于1500 mL 95%乙醇中，物料比 1∶10。

1.2.2 肉樣品處理[15]

稱取約20.00 g經粉碎混勻的午餐肉，置于燒杯中，加70 mL水和12 mL氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L），用玻璃棒混勻，用氫氧化鈉調節樣品的pH為8，定量轉移至200 mL容量瓶中并加入10 mL硫酸鋅溶液，輕搖混勻，如不產生白色沉淀，再補加2 mL～5 mL氫氧化鈉，混勻。置于90℃水浴中加熱10 min，使蛋白質沉淀完全，取出后冷卻至室溫，加水至刻度，混勻。放置0.5 h，撇去上層脂肪，用濾紙過濾，棄去初濾液20 mL，收集濾液備用。

1.2.3 試驗設計

試驗設茶葉浸提溫度、浸提時間、茶葉浸提液用量、茶葉浸提液與亞硝酸鹽反應液的pH和反應時間5個單因素試驗。然后采用正交試驗設計確定茶葉浸提液清除亞硝酸鹽的最佳條件。

1.2.3.1 浸提溫度的確定

取5份2 mL標準亞硝酸鈉溶液，分別加入60、70、80、90、100℃水浴浸提40 min的茶葉浸提液25 mL，用乙酸調節反應液pH為5.0，反應20 min，測定清除率。

1.2.3.2 浸提時間的確定

取6份2mL標準亞硝酸鈉溶液，分別加入90℃水浴浸提 10、20、30、40、50、60min 的茶葉浸提液 25mL，調pH為5.0，20 min后，測定清除率。

1.2.3.3 茶葉浸提液用量的確定

取5份2 mL標準亞硝酸鈉溶液，分別加入90℃水浴浸提 40 min 的茶葉浸提液 4、6、8、10、12 mL，用乙酸調節pH 5.0，20 min后，測定清除率。

1.2.3.4 反應液pH的確定

取5份2 mL標準亞硝酸鈉溶液，加入90℃水浴浸提40 min的茶葉浸提液10 mL，用乙酸調節反應液pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，20 min 后，測定清除率。

1.2.3.5 反應時間的確定

取6份2 mL標準亞硝酸鈉溶液，加入90℃水浴浸提40 min的茶葉浸提液10 mL，調節反應pH為5.0，分別反應 10、15、20、25、30、35 min，測定清除率。

1.2.3.6 正交試驗選擇最佳條件

根據上述5個單因素試驗結果，選擇影響亞硝酸鹽清除效果的4個主要因素，進行L16（44）正交試驗，找出茶葉浸提液清除亞硝酸鹽的最佳工藝條件。

上述試驗均重復3次。

1.2.4 亞硝酸鹽清除率測定[16]

1.2.4.1 體外亞硝酸鹽清除率測定

準確量取亞硝酸鈉應用液兩份各2 mL，分別置于50 mL容量瓶中，一份加入一定量的茶葉提取液，搖勻，反應一定時間。另一份做空白試驗。（同時再吸取不同濃度的亞硝酸鈉標準溶液置于比色管中，按下面的操作進行，最后以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線）。兩份都加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻靜置4 min，加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，加入2 mL氯化胺緩沖液，加水定容至刻度；靜置15 min，用1 cm比色皿以零管為空白，于540 nm處測得吸光度，分別計A1（加入茶葉浸提液測得值）、A2（未加入茶葉浸提液測得值）。

計算：清除率/%=[（A2-A1）/A2]×100

1.2.4.2 肉制品中亞硝酸鹽清除率測定

取2份午餐肉勻漿各2 mL，其中一份加入茶葉浸提液（90℃水浴40 min），調節反應pH為5.0，反應20 min；另一份做空白。然后將勻漿全部洗入50 mL容量瓶中，按體外亞硝酸鹽清除率測定方法操作比色。計算茶葉浸提液對肉制品中亞硝酸鹽的清除率。

1.3 數理統計與分析方法

對所得數據用EXCEL數理統計分析軟件整理、作圖、制表，結果以平均值表示。所得數據用SPSS16.0軟件進行SSR及LSR多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 影響茶葉浸提液對亞硝酸鹽清除作用的主要因素

影響茶葉浸提液對亞硝酸鹽清除作用的主要因素見圖1。

由圖 1（a、b、c、d、e）可以看出，浸提溫度、浸提時間、浸提液用量及反應時間和反應液pH均會影響到茶葉浸提液對亞硝酸鹽的清除效果，其中浸提液用量對清除率的影響表現為逐漸上升的趨勢，其余因素對清除率的影響均表現為先上升后下降的趨勢。以90℃浸提獲得的茶葉浸提液對亞硝酸鹽清除效果最好，為46.57%；以浸提40 min獲得的茶葉浸提液對亞硝酸鹽清除率最大，為52.45%；以反應20 min的清除率最大，為47.87%；以pH 5.0的反應液清除效果最好，為40.72%；以12 mL浸提液用量清除率最大，為51.74%，但用量10 mL與用量12 mL的清除率差異不大。

圖1 影響茶葉浸提液對亞硝酸鹽清除作用的因素Fig.1 The effect factors of tea extract on eliminating nitrite

2.2 正交優化確定茶葉浸提液清除亞硝酸鹽的最佳工藝條件

根據上述單因素試驗可知：反應至第20分鐘時整個反應基本結束，所以該因素是一個固定的因素，因而選取浸提溫度、浸提時間、浸提液用量和反應pH 4個因素（表1）進行L16（44）正交試驗，以確定茶葉浸提液降低亞硝酸鹽殘留的最佳條件。正交結果見表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交試驗結果Table 2 The results of the orthogonal test

從表2正交結果可知，各因素對降低肉制品中亞硝酸殘留量的影響主次順序為；茶葉浸提液用量C＞浸提溫度A＞pH D＞浸提時間B。

進一步通過方差分析（表3）表明，茶葉浸提液用量C、浸提溫度A、pH D對降低亞硝酸鹽殘留量的影響均達到0.05差異顯著水平。結合正交試驗K值分析與方差分析結果，對A、B、C 3個因素進行LSR法多重比較（表 4），結果表明 A2、C4、D2為清除亞硝酸鹽的最優水平，但C3和C4差異不顯著，D1和D2差異不顯著。也就是說，K值分析與方差分析得出的最佳工藝條件為A2B2C4D2，即浸提溫度90℃，浸提時間40 min，浸提液用量14 mL，反應液pH5.0。而根據清除率得出的最佳工藝條件為A2B4C3D2，即浸提溫度90℃，浸提時間60 min，浸提液用量12 mL，反應液pH5.0（表2第8號正交試樣）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

表4 A因素和C因素各水平LSR法多重比較Table 4 Multiple comparison of each lever typical value of A and C by LSR

將兩組工藝條件A2B2C4D2與A2B4C3D2進行對照實驗，測定清除率。其結果如表5所示。

表5 兩種最佳工藝條件的清除率比較Table 5 Elimination rate comparison of two kinds of the optimum elimination conditions

由表5可以看出，茶葉浸提液降低亞硝酸鹽殘留量的最佳工藝條件為A2B4C3D2，即取90℃水浴浸提60 min的茶葉浸提液12 mL，在pH5.0的反應液中反應20 min，對體外亞硝酸鹽的清除率可達56%以上。

2.3 最佳試驗組茶葉浸提液清除肉制品中亞硝酸鹽的效果

為了明確上述最佳工藝條件下獲得的茶葉浸提液對肉制品中亞硝酸鹽的清除率，試驗以午餐肉和火腿腸為材料，測定了其對亞硝酸鹽的清除率，結果見表6。

表6 最佳試驗組茶葉浸提液清除肉制品中亞硝酸鹽的效果Table 6 Eliminating effects of the optimum tea extract on nitrite of meat products

從表6可以看出，茶葉浸提液對午餐肉和火腿腸中亞硝酸鹽的清除率分別為48.14%和44.45%。可見茶葉浸提液對肉制品中亞硝酸鹽的清除效果較好。

3 討論

3.1 制備茶多酚的方法

目前從茶葉中制備茶多酚的傳統方法主要分為以下3類[14]：（1）溶劑提取法，即將茶葉用極性溶劑浸漬，然后把浸取液進行液—液萃取分離，最后濃縮得到產品。由這種方法制取的茶葉浸提液為粗提純液，產品收率在5%～10%之間。（2）離子沉淀法，用金屬沉淀茶多酚，使其與咖啡堿分離。由于此方法使用了對人體有毒的重金屬作沉淀劑，所以，生產的產品難以達到食品和醫藥行業的要求。（3）柱分離制備法，已有報道的凝膠柱、吸附柱和離子交換柱法。此項技術的關鍵是柱填充料和淋洗。研究表明，采用柱分離制備法，茶多酚獲得率在4%～8%之間，但柱填充料非常昂貴，而且淋洗時要用多種且大量的有機溶劑，顯然不適合工業化生產。因此，考慮到產品安全性、價格和純度等多種因素，本試驗選擇第一種制備方法，即溶劑提取法制備獲得茶多酚。

3.2 茶葉浸提液清除亞硝酸鹽殘留的影響因素

由試驗結果可以看出，影響茶葉浸提液清除亞硝酸鹽殘留的主要因素是浸提液用量、浸提溫度及反應液pH。由于提取茶多酚工藝對試驗設備及作業環境要求嚴格，提取技術難度大，因此本試驗茶葉浸提液里的主要成份并非完全是茶多酚類物質，可能還含有大量的咖啡類及色素類等影響試驗準確程度的物質，因此本試驗最關鍵的步驟就是確定浸提液中茶多酚含量及浸提液用量。當茶葉浸提溫度接近90℃時，浸提液中的茶黃素、茶紅素和茶褐素與咖啡堿之間呈離子狀態，從而進行分光光度值的準確測定；而隨著溫度降低，茶多酚容易與茶葉中的咖啡堿通過氫鍵的締合作用生成絡合物（如茶乳酪），從而表現出膠體特征[17]，影響分光光度值的準確測定。同時由于茶多酚容易氧化變質，因此制備過程中要盡量小心浸提液被氧化，要使茶葉浸提液保存在相對密閉的環境中，防止其中的茶多酚被氧化成茶黃素、茶紅素和茶褐素等一系列有色化合物而影響被測物質的分光光度值。另外茶葉浸提液在酸性環境中的清除效果要好于堿性條件下，這主要是因為茶多酚類物質呈弱酸性且在pH 4～7下較為穩定。

由于茶多酚特有的天然抗氧化能力不會影響肉制品的保質期與風味，因此筆者認為，隨著在生物技術領域內天然大分子物質提取技術的不斷改進，茶多酚類物質作為一種良好的天然食品添加劑以及其特有的抗氧化、改善食品風味和延長食品貯存期的特點，將在食品添加劑領域內有很樂觀的市場前景和可觀的經濟效益。

4 結論

茶葉浸提液清除亞硝酸鹽的最佳工藝參數是：90℃水浴浸提茶葉60 min，取12 mL浸提液在pH為5.0的反應液中反應20 min，對體外亞硝酸鹽的清除率最大，達56.83%。茶葉浸提液對肉制品中亞硝酸鹽的清除效果可以達到44%以上。本研究為提高肉制品的食用安全性提供參考。

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