葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的研究

趙濤，高聚林，董義珍，包志華，其木格，王勇

（1.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古商貿職業(yè)學院，內蒙古 呼和浩特 010070）

葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的研究

趙濤1，2，高聚林1，*，董義珍2，包志華2，其木格2，王勇2

（1.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古商貿職業(yè)學院，內蒙古 呼和浩特 010070）

以油葵、食葵的葵花籽仁除油后乙醇提取物為研究對象，在測定其提取物中總酚酸含量的基礎上，用K3［Fe（CN）6］測定了它們的還原力；采用D－脫氧核糖－鐵體系、超氧陰離子自由基體系、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）體系進行抗氧化活性的研究，并同Vc進行了比較。結果表明：油葵、食葵的葵花籽仁粕乙醇提取物均有顯著的抗氧化性，呈劑量效應關系，其中葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化活性與其總酚含量密切相關。當葵花籽仁粕多酚濃度為0.05 mg/mL時，對DPPH·的清除率都超過了95%；當多酚濃度為0.2 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除率，油葵、食葵分別為57.83%、45.24%；對·OH的清除率，油葵、食葵分別達到77.61%、68%；在實驗濃度范圍內0.005 mg/mL～0.2 mg/mL，葵花籽粕乙醇提取物的抗氧化性高于VC。

葵花籽；乙醇提取物；抗氧化性

向日葵（Helianthus annuus L.）是菊科（Compositae）向日葵屬（Helianthus）的一年生植物。原產于北美洲南部、西部以及秘魯和墨西哥北部的干旱地區(qū)。一般可分為油用型（oil－type sunflower） 和食用型（edible－type Sunflower）2種類型，我國已有18個省市（自治區(qū)）種植向日葵，產區(qū)主要分布在東北、華北和西北半干旱、輕鹽堿地區(qū)，其中內蒙古栽培面積最大[1]。

無論是油葵還是食葵，均具有較高的營養(yǎng)價值。除了含有脂肪、蛋白質、維生素和微量元素外，還含有甾醇、皂甙、膽堿、木脂素和酚類化合物。這些化合物是葵花籽發(fā)揮抗氧化作用的主要物質。王放銀等研究證明葵花籽殼綠原酸提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌均有明顯的抑菌作用[2]。陳少洲等的研究結果表明，向日葵籽酚酸中的綠原酸（CGA）、咖啡酸（CA）可以抑制低密度脂蛋白（LDL）發(fā)生過氧化反應，減少過氧化脂質的生成，從而阻止氧化低密度脂蛋白（oxLDL）對內皮細胞的損傷[3]。

酚類化合物是一族具有生物活性的物質，廣泛存在于植物中，其本身的酚羥基結構極易與自由基反應，提供質子和電子使其失去反應活性，故具有顯著的抗氧化特性。研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物具有延緩腫瘤的發(fā)作、抑制腫瘤的形成、抑制低密度脂蛋白氧化及抑制血小板凝集等功能，這些功能都與其抗氧化性能有關。向日葵是酚類含量較高的植物，其中綠原酸和咖啡酸的含量最高。國內長期以來對向日葵的研究主要集中在提取物和它的一些單獨成分的研究上，而對某些重要成分在總的提取物里面所起的作用沒有做過相關的研究。本實驗用一些典型的體外抗氧化體系，分析向日葵籽仁乙醇提取物與等量抗壞血酸的抗氧化能力差異，揭示其抗氧化作用與其含量的內在關系及其抗氧化作用的物質基礎，為進行向日葵籽類的開發(fā)提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

食葵：RH118；油葵：巴葵雜4號；葵花籽仁粕乙醇提取物：內蒙古農業(yè)大學農業(yè)信息實驗室自制，原料來自內蒙古包頭市土右旗境內的內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院生產基地。

1.2 試劑

脫氧核糖、抗壞血酸（VC）、DPPH·、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、EDTA、三氯化鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰苯三酚、氯化鈉、硫酸亞鐵等均為分析純。

1.3 主要儀器

PHS-3C pH計：上海雷磁儀器廠；電子天平：德國Sartorius公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FD-1冷凍干燥機：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；RE52-99旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠等。

1.4 方法

1.4.1 葵花籽仁粕乙醇提取物的制備方法

將葵花籽仁粉碎去油后過80目篩，用75%乙醇提取，料液比1∶13（g∶mL），40 ℃提取3次，然后于45 ℃減壓旋轉蒸發(fā)，濃縮液于10000r/min、1℃～4℃離心30min，收集上清液，冷凍干燥后得樣品葵花籽仁粕乙醇提取物。

1.4.2 葵花籽仁乙醇提取物酚酸含量的測定方法

酚酸含量的測定采用Foiln－Ciocalteμ法（用原兒茶酸作標準物）[4]。準確移取一定濃度的各待測樣品提取液100 μL，分別加入Folin酚試劑1 mL，10%Na2CO3溶液5 mL，然后用純凈水定容至10 mL，混合均勻，常溫下避光暗反應1 h，于760 nm波長下測定吸光值。葵花籽仁粕乙醇提取物中的酚酸含量表示為相當于原兒茶酸的質量。

1.4.3 還原能力的測定

方法[5]，并略作改進。取2.5 mL的不同樣品（空白用1mL蒸餾水代替，其他試劑依次同下）溶液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH＝6.6）及1%的K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，于50 ℃水浴反應20 min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，取反應液5 mL，加入5 mL的H2O和0.1%的FeCl3溶液1 mL，混合均勻，10 min后于700 nm處測定其吸光度值，以水為空白。以下實驗均以抗壞血酸作陽性對照。濃度設計：0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/mL（樣品濃度指加入反應體系前樣品的濃度，以下同）。

1.4.4 對羥基自由基的清除作用

采用D-脫氧核糖-鐵體系法[6-7]。在潔凈干燥的試管中依次加入0.4 mL 50 mmol/L的KH2PO4-KOH緩沖液，一定濃度的樣品，0.1 mL 1.04 mmol/L的EDTA溶液，0.1 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液，0.1 mL10 mmol/L的H2O2，0.1 mL 60 mmol/L的DR （其中對照不加），0.1 mL 20 mmol/L的VC，保證每管最終體積為1 mL，于37℃下保溫1 h，取出迅速加入25%的鹽酸1 mL終止反應，加1 mL 1%的TBA，于沸水浴上煮沸15 min，立即冷卻，若有混濁加入3 mL正丁醇萃取，于532 nm下比色，測吸光度。清除率按以下公式計算：

式中：A0為空白吸光度；A1為加入清除劑和DR后吸光度；A2為樣品本身吸光度（不加DR）。

1.4.5 對超氧陰離子的清除作用

參照鄰苯三酚自氧化法[8]。取0.2 mL不同濃度的樣品稀釋液，加入4.6 mL 0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.2）振蕩混勻，25℃水浴10 min加入0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚（25℃預熱）。迅速混勻并開始計時，325 nm測定吸光度，每隔30 s讀取A325，4 min后結束。空白對照組以0.2 mL蒸餾水代替樣品，作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為V對照，清除率按以下公式計算：

式中：V對照為鄰苯三酚的自氧化速率；V樣品為加入樣品后鄰苯三酚的氧化速率。

1.4.6 對DPPH自由基的清除作用

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一種很穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當有自由基清除劑存在時其顏色減退，褪色程度與清除劑的清除能力及數(shù)量呈定量關系。因此，可用分光光度法進行定量分析，從而評價抗氧化物質的抗氧化能力[9-10]。

將2 mL溶劑與2 mL 20 mmol/L DPPH·溶液加入同一試管中，搖勻，放置30 min，用溶劑作參比測定其吸光度（即A空），測定樣品清除能力時，所取試劑同前，只是分別加2 mL樣液代替2 mL溶劑，靜止30 min后測A值（用同濃度樣液作為參比）即為待測管光吸收值（即A樣）。清除率按以下公式計算：

2 結果與分析

2.1 不同品種葵花籽仁粕乙醇提取物中的總酚酸含量

酚類化合物是廣泛存在于水果、蔬菜和谷類食物中的植物次生代謝產物，有多種生物活性，尤其在預防心腦血管、癌癥以及衰老方面發(fā)揮著十分重要的作用。同其它的果實相比，向日葵籽仁中含有較多的酚酸類物質，其中約70%是綠原酸[11]，咖啡酸的含量也較高。本文采用Folin-Ciocalteu法測定主產于內蒙古地區(qū)2個向日葵品種乙醇提取物中的總酚酸含量，結果見表1。

表 1 葵花籽仁粕乙醇提取物的總酚含量aTable 1 Total phenolic contents of sunflower seed ethanol extractsa

從表1可知，2種葵花籽仁粕乙醇提取物中總酚酸含量存在一定差異，其中油葵乙醇提取物總酚酸含量較食葵高，每克提取物中含有（26.36±3.27）mg總酚酸。

2.2 葵花籽仁粕乙醇提取物還原能力

還原力是表示抗氧化物質提供電子能力的重要指標，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性[12]。由圖1可以看出，葵花籽仁粕乙醇提取物在低濃度下，A700值比較小，說明低濃度下還原能力比較差；但當濃度大于0.01mg/mL時，隨著濃度的增大，A700值也增大，還原能力增加幅度較大。即在反應體系中，葵花籽仁粕乙醇提取物加入的量越多，吸光值越大，還原力越強。在相同濃度下，油葵的還原力最強，并且葵花籽仁粕乙醇提取物的還原力顯著高于VC。相關分析表明，不同劑量下葵花籽仁粕乙醇提取物的還原力與其總酚含量存在正相關，表明葵花籽仁粕乙醇提取物的還原力與其總酚含量有關，即提取物中總酚含量越高，還原能力也越高。這也是油葵提取物還原力高于食葵的主要原因。

2.3 葵花籽仁粕乙醇提取物對羥基自由基的清除能力

羥自由基是目前所知活性氧中對生物體毒性最強，危害最大的一種自由基[13]。它可以與生物體內的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質氧化性的損傷，使細胞壞死或突變[14]。羥自由基清除率是反映物質抗氧化作用的重要指標[15]。葵花籽仁粕乙醇提取物中酚類化合物能夠提供電子和質子氫，與羥基自由基反應，尤其是葵花籽仁粕乙醇提取物中的綠原酸，分子中含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，可以消除羥基自由基的活性，保護組織免受氧化作用的損害，提取物對羥基自由基的清除能力見圖2。

由圖2可以看出，在實驗濃度范圍內（0.005mg/mL～0.2 mg/mL），VC和葵花籽仁粕乙醇提取物對脫氧核糖－鐵體系產生的·OH均表現(xiàn)出一定的抑制作用，并隨著濃度的增加，清除率增大。VC和葵花籽仁粕乙醇提取物在低濃度下清除率有上升的情況，即在濃度小于0.05 mg/mL時，清除率隨濃度的增加上升緩慢，而在濃度高于0.05 mg/mL時，產生明顯而且穩(wěn)定的清除作用。在實驗的濃度范圍內油葵、食葵清除率可達77.61%、68%，它們與VC對羥基自由基的清除作用趨勢一致。

2.4 葵花籽仁粕乙醇提取物對超氧陰離子的清除能力

葵花籽仁粕乙醇提取物對超氧陰離子的清除能力，見圖3。

如圖3所示，在濃度低于0.02 mg/mL時，VC、葵花籽仁粕乙醇提取物對鄰苯三酚自氧化體系產生的O2-·沒有清除能力，在濃度高于0.02 mg/mL時，VC、葵花籽仁粕提取物對鄰苯三酚自氧化體系產生的O2-·有一定的清除作用，且隨加入量的增加，清除率上升，量效關系明顯。在濃度高于0.1 mg/mL時，清除率呈直線上升趨勢。在0.2 mg/mL時，油葵和食葵的最大清除超氧陰離子可達57.83%和45.24%，說明高濃度的VC和葵花籽仁粕乙醇提取物對超氧陰離子有很強的清除作用。

2.5 葵花籽仁乙醇提取物對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，在517 nm處有一吸收峰。當反應系統(tǒng)中存在自由基清除劑時，它可以和DPPH·的單電子配對而使517 nm處的吸收峰漸漸消退。根據(jù)消退速度和峰值改變程度可了解反應系統(tǒng)中自由基清除劑的反應速度和能力[16-17]。用DPPH·篩選自由基清除劑具有簡便、快速、靈敏和直接可行的優(yōu)點[18]，因此目前國內外用DPPH·法測定抗氧化能力。通過研究葵花籽仁粕乙醇提取物和VC對DPPH·溶液清除率的大小，以確定葵花籽仁粕乙醇提取物抗氧化性的大小。清除率越大，抗氧化性越大，提取物對DPPH·的清除作用見圖4。

從圖4可以看出，VC、葵花籽仁粕乙醇提取物對DPPH·的清除作用隨濃度升高逐漸增強，在0.2 mg/mL時，清除率約100%，基本將DPPH·清除完全，而且葵花籽提取物的清除作用與VC接近。由此可以看出，葵花籽仁粕乙醇提取物對DPPH·有很強的清除能力，說明葵花籽仁粕乙醇提取物是良好的質子供體，并有可能反應生成更穩(wěn)定的物質，可作為抗氧化劑。

3 結論

不同品種葵花籽仁粕乙醇提取物中總酚酸含量存在差異，油葵籽仁粕乙醇提取物中的總酚酸含量高于食葵。葵花籽仁粕乙醇提取物的還原力與其總酚酸含量有關，即提取物中總酚酸含量越高，還原能力也越大。

葵花籽仁粕乙醇提取物中具有明顯的抗氧化能力，抗氧化能力與其中酚酸物質的含量有相關性。酚酸含量高的油葵籽仁粕乙醇提取物對抑制·OH、清除超氧陰離子和DPPH·的能力高于食葵，并且葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化性高于VC。以上研究表明葵花籽仁粕乙醇提取物有較強的抗氧化活性，從化學本質上證實了葵花籽仁粕乙醇提取物的抗氧化能力，為進行葵花籽仁粕乙醇提取物的生物活性或相關保健品的研究提供理論基礎，為以后的深入研究提供了參考。

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Study on Antioxidant Effects of Sunflower Seed Extract from Ethanol

ZHAO Tao1，2，GAO Ju－lin1，*，DONG Yi－zhen2，BAO Zhi－h(huán)ua2，QI Mu－ge2，WANG Yong2
（1.Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010010，Inner Mongolia，China；2.Inner Mongolia trade Vocational College，Hohhot 010070，Inner Mongolia，China）

Ethanol extracts of the oil－sunflower seed and edible－sunflower seed meal was studied，the determination of total in the extract phenolic acids content，Comparing with VC，the antioxidation activity was studied by D－deoxyribose－iron system，superoxide anion radical system，and DPPH·system，with K3[Fe（CN）6]evaluating their capacity deoxidizing.The results demonstrated that all tested sunflower seed meal ethanol extracts showed very good antioxidant activity with dose－effect dependent，and the positive correlation among the content of total phenolics.Results of the antioxidation indicated that the rate of scavenging DPPH was over 95%when concentration of polyphenols was 0.05 mg/mL；the inhibitory rate of the oil－sunflower and ediblesunflower to O2－·was 57.83%，45.24%and to·OH was 77.61%，68%when concentration of polyphenols was 0.2 mg/mL；in the concentration range 0.005 mg/mL-0.2 mg/mL，sunflower seeds meal ethanol extracts oxidation stability than VC.

sunflower seed；ethanol extracts；anti－oxidation

趙濤（1974—），女（漢），講師，在讀博士研究生，主要從事農產品加工。

*通信作者：高聚林，教授，主要從事作物生理生態(tài)及決策系統(tǒng)的研究。

2011-07-26