正交試驗法優化香柏（變種）中總黃酮提取工藝

楊梅，王文蘭，張嫦，劉東，王曉玲

（西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 610041）

正交試驗法優化香柏（變種）中總黃酮提取工藝

楊梅，王文蘭，張嫦，劉東，王曉玲*

（西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 610041）

研究提取香柏總黃酮的最佳工藝條件。以總黃酮的得率為考察指標，溶劑回流作為提取手段，利用單因素和正交試驗，考察提取溫度、提取時間、乙醇溶液體積分數、液固比以及提取次數對總黃酮得率的影響。最優工藝條件為：在80℃水浴條件下，提取時間90 min、乙醇溶液體積分數60%、液固比50∶1（mL/g）、提取次數3次。在最優工藝條件下總黃酮的提取率可達7.68 g/100 g。該方法操作方便、準確可靠，可以用于工業化生產。

香柏（變種）；總黃酮；回流提取；正交試驗

香柏（變種）[Sabina Pingii（cheng ex Ferre）Cheng etW.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu]為柏科圓柏屬植物。在我國主要分布于四川、云南、青海、西藏等高海拔地區。馬明芳[1]等對香柏植物的水提取物進行過系統的研究，從中分離純化出13個化合物，其中5個黃酮，2個雙黃酮，HPLC分析表明槲皮苷為其主要成分之一。黃酮類化合物具有多種生物活性，如抗潰瘍、抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌、血管舒張、抗癌及降血脂等系列生物活性，具有高效低毒的優勢，廣泛用于醫藥、食品等行業，具有極廣的開發應用前景[2-5]，尤其是植物中黃酮化合物以其純天然、高活性、見效快等特點得到國內外科研人員的極大關注，目前已開發了多種藥用植物黃酮產品[5-6]。因此，研究從香柏中提取黃酮類化合物對香柏的開發利用具有很大的價值。以香柏總黃酮含量為考察指標,采用單因素和正交試驗L9（34）法進行實驗,對影響提取率的提取溫度、乙醇溶液體積分數、提取時間、提取次數及液固比5個因素進行研究，優選出香柏中總黃酮的最優提取工藝條件，為促進該植物的有效開發利用和進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

香柏采自四川阿壩州小金縣。

槲皮苷（由西南民族大學少數民族藥物研究所313實驗室從香柏中分離純化，結構經質譜、紫外、紅外、核磁共振譜進行確認，純度經HPLC分析達到99.3%），其他試劑均為國產分析純試劑。

UV-1901紫外分光光度計、METTLER AE240電子天平：北京普析通用；W201恒溫水浴鍋：SENCO。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

據相關文獻報道[7]，在亞硝酸鹽存在時，Al（NO3）3在堿性條件下與黃酮類化合物形成絡合物，在一定波長下有穩定吸收峰，以此進行比色分析，標準品選用槲皮苷。

準確稱取50℃下真空干燥至恒重的槲皮苷標準品147.6 mg，置于100 mL容量瓶中，加入95%的乙醇溶劑并定容至100 mL，搖勻。用移液管精密量取10 mL置于100 mL容量瓶中，加入95%的乙醇溶劑并定容至100 mL，搖勻得質量濃度0.147 mg/mL的槲皮苷標準品溶液。分別精密量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL配好的濃度為0.147 mg/mL的槲皮苷標準品溶液，分別置于50 mL容量瓶中，各加入95%乙醇稀釋至12.0 mL，加5%NaNO2溶液2.0 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液2.0 mL，搖勻，放置6 min，加5%NaOH溶液20 mL，最后用95%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以第1瓶為空白液，在500 nm的最佳波長處測定吸光度A值，以A值為縱坐標、槲皮苷的含量（mg/mL）為橫坐標作圖得標準曲線。用最小二乘法作線性回歸，回歸方程為y=12.923x-0.0048，r=0.9994。結果表明槲皮苷濃度在0.017 mg/mL～0.040 mg/mL之間呈線性關系，滿足含量測定要求[8]。

1.2.2 提取工藝流程

香柏枝葉→自然陰干→粉碎→乙醇回流提取→抽濾→濾液濃縮→香柏總黃酮提取物

1.2.3 單因素條件

分別對提取溫度、提取時間、乙醇溶液體積分數、液固比、提取次數進行考察。

1.2.4 正交試驗條件

提取黃酮類化合物過程中受多個因素影響，為了得到提取黃酮類化合物的較科學的方法，我們以乙醇-水為提取介質，用回流提取方法，將乙醇溶液體積分數、提取時間、液固比、提取次數作為考察對象設計四因素三水平的正交試驗，每個試驗重復3次，取平均值作為結果，對回流提取工藝進行優化。因子水平設計見表1。1.2.5 香柏總黃酮含量的測定及提取率的計算方法

表 1 正交因子水平表L9（34）Table 1 The factor levels of design in orthogonal test method

準確稱取香柏干粉100.0 g放入1000 mL的圓底燒瓶中，用回流提取，在一定時間、一定乙醇溶液體積分數、一定提取次數、一定液固比的條件下提取；過濾，合并濾液，濃縮，然后用無水乙醇定容至100 mL。準確吸取5 mL提取液，在1.2.1同樣的實驗條件下，測定樣品的吸光度，利用回歸方程，進而計算香柏中總黃酮的得率。

香柏總黃酮含量=（提取黃酮的質量/香柏干粉的質量）×100%

2 結果與分析

2.1 香柏黃酮提取工藝單因素試驗

2.1.1 提取溫度對總黃酮提取的影響

精密稱取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圓底燒瓶中，以體積分數60%的乙醇溶液作為提取劑，液固比為20∶1，回流提取，提取1次，提取溫度分別為60、70、80、90、100℃5個水平，測定總黃酮得率，結果見圖1。

圖1結果顯示，隨著溫度的升高，總黃酮得率變化不大，基本成一直線，因此提取溫度暫定為80℃。

2.1.2 提取時間對總黃酮提取的影響

精密稱取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圓底燒瓶中，以體積分數60%的乙醇溶液作為提取液，液固比20∶1，回流提取溫度80℃，提取1次，提取時間分別為30、50、70、90、110 min 5個水平，測定總黃酮得率，結果見圖2。

圖2結果顯示，回流提取隨著時間的延長其提取率不斷增加，但在70 min過后,隨著時間的延長，其提取率沒有明顯的變化。其原因在于：由于提取包括擴散、滲透和溶解等過程，時間的增加有助于黃酮類化合物的溶出,從而提取率呈上升趨勢，所以提取時間愈長，提取愈完全[9]，70 min以后黃酮提取基本完全，隨著時間的增加黃酮提取率變化不大。

2.1.3 乙醇溶液體積分數對總黃酮提取的影響

精密稱取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圓底燒瓶中，分別用體積分數45%、60%、75%、80%、95%的乙醇作為提取劑，液固比20∶1，回流提取，提取溫度為80℃，提取次數為1次，提取時間為50 min，測定總黃酮得率，研究不同乙醇溶液體積分數對總黃酮提取率的影響，結果見圖3。

圖3結果顯示，當乙醇溶液體積分數低于60%時，香柏總黃酮的提取率逐漸增加。其原因可能是在水中溶解度小的黃酮，比如：槲皮苷，柏黃酮等水溶性差醇溶性好的成分，在醇中溶解度大，所以隨著乙醇溶液體積分數的增大，香柏總黃酮的提取率呈上升趨勢；當乙醇溶液體積分數增大到60%時，提取率最大，此時醇溶性黃酮基本提取完畢，達到動態平衡；當乙醇溶液體積分數再增加時，提取率反而下降，其原因可能是香柏總黃酮中水溶性黃酮較多，所以醇溶液體積分數增加，水含量減少，使得水溶性黃酮的提取率下降，同時乙醇溶液體積分數高，提取液沸點下降過大，同時一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，與黃酮類化合物競爭和乙醇、水結合，從而導致黃酮類化合物提取率下降[10-12]。故適宜的乙醇溶液體積分數可能為60%。

2.1.4 液固比對總黃酮提取的影響

精密稱取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圓底燒瓶中，以體積分數60%的乙醇作為提取液，回流提取溫度80 ℃，提取1次，液固比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）5個水平，測定總黃酮得率，結果見圖4。

圖4結果顯示，當液固比小于40∶1時，隨著液固比的增大提取含量呈上升趨勢，并且在液固比為40∶1時，總黃酮提取率達到最大；當液固比高于40∶1時，隨著液固比的增大反而呈下降趨勢。其原因在于：液固比影響溶劑的極性，從而影響了不同極性黃酮類的溶解性；當液固比越大，乙醇中提取出的總黃酮濃度相對較小，傳質阻力較小，有利于原藥中黃酮化合物的溶出，但是液固比太大，后續處理時間延長，在較長時間的加熱過程中對熱不穩定的黃酮可能被氧化、分解等。從而提取率降低。因此適宜的液固比選擇在40∶1左右。

2.1.5 提取次數對總黃酮提取的影響

精密稱取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圓底燒瓶中，以體積分數60%的乙醇作為提取液，液固比40∶1，回流提取溫度80 ℃，提取次數分別為1、2、3、4、5次5個水平，測定總黃酮得率，研究不同提取次數對總黃酮提取率的影響，結果見圖5。

圖5結果顯示，香柏中總黃酮的提取率隨著提取次數的增加而增大，提取次數越多總黃酮的提取率越高，但提取次數超過3次以后，黃酮得率變化不明顯。因此，提取次數以3次左右為宜。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果

正交試驗結果，見表2。

表 2 正交試驗結果L9（34）Table 2 The results of orthogonal test method

由極差可以確定回流提取影響因素的大小順序為:B>A>D>C；即乙醇溶液體積分數>提取時間>提取次數>液固比；4種因素組合為A3B1C3D2時提取率最高，為7.68 g/100 g。回流提取最優條件為A3B1C3D2，即提取時間90 min、乙醇溶液體積分數60%、液固比50∶1、提取次數3次。

用SAS統計軟件包對實驗結果進行方差分析，由于正交試驗表中未留空列，沒有誤差自由度，所以無法進行顯著性分析，采取剔除不顯著因素C后再進行方差分析[13]，其結果見表3。

由方差分析可以看出提取時間、乙醇溶液體積分數、提取次數在<0.0001均具有一定的顯著性，在試驗中要注意控制。

表 3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

3 結論

采用單因素及正交試驗設計對香柏總黃酮的提取工藝條件進行優化。香柏總黃酮的最佳提取工藝條件為：在80℃水浴條件下回流提取，提取90 min、乙醇溶液體積分數60%、液固比50∶1（mL/g）、提取3次。香柏總黃酮的提取率可達7.68 g/100 g。該提取方法操作簡單、準確可靠，可用于工業化生產。

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Optimization of Total Flavonoids Extraction from Sabina pingii（Cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu Using the Orthogonal Test

YANG Mei，WANG Wen－lan，ZHANG Chang，LIU Dong，WANG Xiao－ling*
（Ethnic Pharmaceutical Institute，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，Sichuan，China）

Determine the optimal condition of extraction for total flavones in Sabina pingii（cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu.Extractions of Reflux was investigated.During the extracting process，five main factors including，extraction temperature，processing time，concentration of extracting solution，liquid－solid ratio，extraction times were studied by using single factor analysis method.Based on the single－factor experiment，the best conditions of extracting total flavones were optimized by orthogonal test.The optimums of reflux extraction were：extracted in 80 ℃ water bath，ethanol concentration 60%，processing time 90 min；extraction times 3，liquid－solid ratio 50∶1（mL/g）；under the above conditions，the total flavones yield 7.68%.Those extraction methods were simple，rapid and applicable for the extraction of total flavones in Sabina pingii（cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu.

Sabina pingii（Cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.Wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu；total flavones；reflux extraction；orthogonal test

中央高校基本科研業務費專項資金（No:11NFW02）

楊梅（1986—），女（苗），在讀碩士研究生，研究方向：天然藥物化學。

*通信作者：王曉玲（1969—），女，副教授，博士，研究方向：天然藥物化學。

2011-07-20