脹果甘草懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物HPLC分析

李雅麗，王紅霞，楊英，付春華，余龍江，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

脹果甘草懸浮細(xì)胞中黃酮類化合物HPLC分析

李雅麗1，2，王紅霞2，楊英1，付春華1，余龍江1，*

（1.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

用HPLC法建立野生脹果甘草與懸浮培養(yǎng)的脹果甘草細(xì)胞中黃酮類化合物的HPLC指紋圖譜，并采用LC-MS技術(shù)推測(cè)HPLC共有峰中主要指紋峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)。采用Agilent EclipseXDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈：0.1%冰醋酸，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm。Agilent1100LC/MSD液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，ESI源。在設(shè)定的色譜條件下，分別得到的野生甘草與甘草細(xì)胞中黃酮類化合物指紋圖譜，用中國(guó)藥典相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)相似度為75.2%，根據(jù)LC-MS結(jié)果推斷了HPLC共有峰中2個(gè)主要指紋峰分別為甘草苷和甘草素。結(jié)果表明野生甘草中絕大部分黃酮類化合物在甘草細(xì)胞中均有合成，使利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的甘草黃酮類化合物成為可行的途徑。

甘草；黃酮類化合物；細(xì)胞培養(yǎng)；指紋圖譜

脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）為豆科多年生草本植物甘草的一個(gè)品種，其根及莖入藥，甘草的現(xiàn)代化學(xué)及藥理活性研究重點(diǎn)主要集中在以甘草酸為代表的三萜類化合物和甘草苷等黃酮類化合物上。甘草黃酮類化合物主要是指2個(gè)苯基通過三碳鏈相連形成，即具有C6-C3-C6基本骨架的化合物,包括黃酮醇、異黃酮、查爾酮及它們的二氫衍生物等[1]。甘草黃酮類化合物具有多種生物活性，在消炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等方面有明顯的藥理作用，也廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)。近年來天然甘草面臨嚴(yán)重的資源問題，同時(shí)無節(jié)制的采挖直接導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境的惡化，而栽培品種周期長(zhǎng)、品質(zhì)低，使利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)直接生產(chǎn)甘草黃酮成為研究熱點(diǎn)[2]。本研究對(duì)來自道地產(chǎn)區(qū)新疆的野生脹果甘草與實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞中的黃酮類化合物進(jìn)行了HPLC指紋圖譜分析，同時(shí)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)所得HPLC共有峰中主要指紋峰進(jìn)行質(zhì)譜圖解析，根據(jù)ESI-MS獲得的準(zhǔn)分子離子峰確定化合物的分子量，并根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜所得碎片峰，并參考文獻(xiàn)報(bào)道推測(cè)化學(xué)成分，為甘草細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物提供理論和實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

美國(guó)Agilent1200四元泵液相色譜工作站；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；美國(guó)Agilent1100LC/MSD液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

1.2 材料

野生甘草和甘草種子：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)提供；乙腈、甲醇：色譜純；冰醋酸、乙醇、乙酸乙酯：均為分析純；水為純凈水。相似度計(jì)算軟件為國(guó)家藥典中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版。

2 方法

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱：（4.6 mm×250 mm，5μm，Agilent，USA）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm；進(jìn)樣量：10 μL，洗脫條件經(jīng)優(yōu)化后定為0 min～10 min A相10%；10 min～25 min A相為20%，25 min～40 min A相為40%，40 min后A相60%不變。

2.2 培養(yǎng)細(xì)胞

通過培養(yǎng)無菌苗、誘導(dǎo)愈傷、繼代和馴化得到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的甘草細(xì)胞搖瓶懸浮培養(yǎng)系，在改良的MS培養(yǎng)基[附加2，4－D（2，4－Dichlorophen oxyacetic acid）0.5mg/L；NAA（a－Naphthaleneaceticacid）0.5mg/L；6－BA（Benzyladenine）0.5 mg/L；蔗糖30 g/L；pH5.8]中保存[3]。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好、分散性強(qiáng)的細(xì)胞，以5%的接種量接入250 mL三角瓶中，裝液量100 mL，25℃培養(yǎng)，12 h/d光照，搖床120 r/min,一個(gè)生長(zhǎng)期結(jié)束后，收獲細(xì)胞[4]。

2.3 供試品溶液制備

將野生甘草藥材粉碎過60目篩，50℃烘干至恒重，取粉末約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇10 mL，稱定重量，超聲提取30 min，搖勻，濾過，濾渣重復(fù)提取2次，合并提取液減壓濃縮至無醇后，等量乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液減壓蒸干，用甲醇溶解定容至量瓶中,搖勻,0.45μm濾膜濾過[5-7]。懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞抽濾后，用純凈水洗去表面的培養(yǎng)液殘留后過濾，50℃烘干至恒重，研磨成粉末，黃酮提取同上。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密性試驗(yàn)

取制備的供試樣品1號(hào)，按擬定色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，導(dǎo)出色譜圖數(shù)據(jù)，用相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算其相似度大于98%，測(cè)得峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.56%，說明儀器精密型良好，符合指紋圖譜要求[8]。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，導(dǎo)出色譜圖數(shù)據(jù)，用相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算其相似度大于96%，測(cè)得峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.36%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定可行。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批次的脹果甘草5份，制備樣品溶液，在擬定色譜條件下依次進(jìn)樣測(cè)定，導(dǎo)出色譜圖數(shù)據(jù)，用相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算其相似度大于92%，測(cè)得峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.36%，表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5 相似度分析

數(shù)據(jù)分析和相似度計(jì)算采用國(guó)家食品藥品管理局推薦的專業(yè)軟件-國(guó)家藥典中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版。

2.6 質(zhì)譜條件

ESI源，源電壓3500 V，正離子檢測(cè)，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10.00 L/min，掃描范圍m/z 100～1000。

3 結(jié)果

3.1 野生樣品共有峰的標(biāo)定

根據(jù)設(shè)定的色譜條件,對(duì)野生脹果甘草樣品中提取的黃酮類化合物進(jìn)行測(cè)定，所有成分的色譜峰在40 min之內(nèi)出完，結(jié)果見圖1。

將不同的指紋圖譜疊加、比較，標(biāo)定了相對(duì)峰面積大于1%的18個(gè)共有峰確定為野生甘草黃酮類化合物的指紋峰。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件對(duì)各野生甘草樣品進(jìn)行了相似度比較。不同樣品間相似度均大于0.9，相似度良好，結(jié)果見圖2。

3.2 甘草細(xì)胞樣品共有峰的標(biāo)定

根據(jù)相同色譜條件，對(duì)懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3，同法將不同的指紋圖譜疊加、比較，標(biāo)定了16個(gè)共有峰，結(jié)果見圖4。同法對(duì)各細(xì)胞樣品進(jìn)行比較，相似度大于0.9。

3.3 野生甘草與懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞中黃酮類化合物的指紋圖譜比較

比較設(shè)定條件下得到的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)在同樣濃度和進(jìn)樣量的情況下，野生脹果甘草黃酮類化合物的大部分指紋峰在懸浮培養(yǎng)的脹果甘草細(xì)胞樣品中均有出現(xiàn)，根據(jù)特征峰的保留時(shí)間確定了12個(gè)共有峰，見表1，發(fā)現(xiàn)峰面積均有不同程度降低，部分下降了8倍～15倍以上，如共有峰5、6、8、10和11，部分指紋峰峰面積變化不大，如共有峰3、4、7和9，相似度分析結(jié)果為75.2%，表明通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)甘草黃酮類化合物方法可行。

表 1 野生甘草與甘草細(xì)胞HPLC共有峰Table 1 The common peak of wild licorice and licorice cell

3.4 LC-MS解析

采用LC－ESI－MS技術(shù)（HPLC條件保持不變），參考相關(guān)的文獻(xiàn)，對(duì)野生甘草與甘草細(xì)胞中黃酮類化合物HPLC共有峰中主要指紋峰進(jìn)行了分析，根據(jù)圖譜結(jié)果選擇了正離子模式，部分質(zhì)譜圖與解析過程見圖5。

通過圖5電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果推測(cè)指紋峰峰tR7.178 min的分子量（Mr）為418 u，結(jié)合質(zhì)譜所得分子量和碎片信息[9-11]，推測(cè)為甘草苷（1iquirritin）。指紋峰tR12.163 min的分子量（Mr）為256 u，結(jié)合質(zhì)譜所得分子量和碎片信息，推測(cè)為甘草素（liquiritigenin）[1，11]。此2種化合物結(jié)構(gòu)式分別如下：

4 討論

4.1 HPLC條件的優(yōu)化

為了得到化學(xué)信息豐富、分離效果好的色譜圖，對(duì)流動(dòng)相、梯度洗脫程序和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化[12-14]。選擇甲醇:0.1%冰醋酸、乙腈:0.1%冰醋酸、乙腈:0.1%磷酸水（含少量四氫呋喃）3種組成進(jìn)行洗脫，選擇乙腈：0.1%冰醋酸作為最佳流動(dòng)相，并根據(jù)圖譜對(duì)流動(dòng)相的梯度洗脫程序進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果如2.1所述。采用UV法對(duì)供試樣品在190 nm～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，在310 nm處有最大吸收,選為樣品檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 HPLC指紋圖譜分析

高等植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑極其復(fù)雜，植物細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的體系，內(nèi)部存在多種的正反饋和負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，各種亞體系之間也存在著復(fù)雜的相互影響、相互偶聯(lián)關(guān)系；加上在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中普遍存在的細(xì)胞系不穩(wěn)定、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢等問題致使在目前已經(jīng)研究過的植物中，僅有1/5左右種類的培養(yǎng)物中目的產(chǎn)物的含量接近或超過原植物，多數(shù)情況下細(xì)胞合成某些次生代謝物的能力下降甚至消失。本研究通過對(duì)野生脹果甘草與懸浮培養(yǎng)的脹果甘草細(xì)胞合成的黃酮類化合物進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，在懸浮培養(yǎng)的甘草細(xì)胞中，大部分黃酮類化合物均有合成，由于細(xì)胞生長(zhǎng)內(nèi)外環(huán)境的影響，部分成分的表達(dá)受到抑制，也有部分成分表達(dá)變化不大。

4.3 共有指紋峰LC-MS分析

野生甘草黃酮類化合物HPLC中含量最高的2個(gè)指紋峰tR7.178 min與tR12.163 min在甘草細(xì)胞中均有合成，根據(jù)電噴霧質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜獲得的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道推斷為甘草苷和甘草素。據(jù)現(xiàn)有資料報(bào)道[1，9]，甘草黃酮類的中藥化學(xué)成分主要有甘草素、異甘草素、甘草甙、異甘草甙、新甘草甙、新異甘草甙等，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，其他共有指紋峰的LC－MS分析正在進(jìn)行中。結(jié)果表明用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的甘草黃酮類化合物質(zhì)量相對(duì)良好，是解決目前甘草資源短缺的一條可行途徑。

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Studies on the HPLC Fingerprint of Flavonoids in Suspension Culture Cell of Glycyrrhiza Inflata Bat

LI Ya－li1，2，WANG Hong－xia2，YANG Ying1，F(xiàn)U Chun－h(huán)ua1，YU Long－jiang1，*
（1.School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；2.School of Mathematics，Physics and Biology Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，Inner Mongolia，China）

HPLC method was applied to determine of the fingerprint of flavonoids in wild and cell suspension cultured of Glycyrrhiza inflata Bat，and the chemical constituents of mainly fingerprints among the common HPLC peaks were analyzed by high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry（LC－MS）.Agilent Eclipse XDB－C18column （4.6 mm×250 mm，5μm）was used，the mobile phase was consisted of acetonitrile－0.2%acetic acid with gradient elution，at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 310 nm，and the system of LC－MS was from Agilent 1100LC/MSD with electrospray ionization，under the selected condition，the HPLC fingerprint chromatograms of wild and cultured cell of Glycyrrhiza inflata were established and compared with professional software，the similarity was 75.2%.The two mainly fingerprints among common HPLC peaks were identified as liquiritin and liquiritigenin by the ESI－MS.The results shown that most of flavonoids in radix was synthesized in the suspension cultured cell.

Glycyrrhiza inflate Bat；flavonoids；cell culture；fingerprint

國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2008BAI63B04）；華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新研究基金（Q2009035）

李雅麗（1976—），女（蒙古），副教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。

*通信作者：余龍江（1966—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事資源生物學(xué)與生物技術(shù)研究。

2011-06-07