一株異腸球菌SJR-16-1胞外多糖合成條件的研究

白麗娟，李向東

（1.遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001；2.光明乳業股份有限公司技術中心乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436）

一株異腸球菌SJR-16-1胞外多糖合成條件的研究

白麗娟1，李向東2

（1.遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001；2.光明乳業股份有限公司技術中心乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436）

針對分離自內蒙古錫林郭勒牧區馬奶酒中的41株乳酸菌進行胞外多糖生物合成能力的的研究，篩選出一株胞外多糖產量高的菌株異腸球菌SJR-16-1，分別改變基礎培養基的碳源、氮源以及發酵溫度、時間、pH等條件，探討其對異腸球菌SJR-16-1胞外多糖生物合成能力的影響。優化的培養基的組成為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O 0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。確定其胞外多糖的最佳生物合成條件為：初始pH6.0，發酵溫度35℃，發酵時間14 h，優化的條件顯著提高了EPS的合成量。

異腸球菌；胞外多糖；生物合成

馬奶酒（Kummis）是以鮮馬奶為原料，加入含有乳酸菌、酵母菌等菌種的發酵劑，經科學方法釀制而成的活性乳飲料，在醫療保健作用方面，馬奶酒具有驅寒、活血、舒筋、消食、健胃等功能[1]。

乳酸菌 (lactic acid bacterium，LAB)的胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)是這類細菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的黏液或莢膜多糖[2-3]。

乳酸菌胞外多糖可以作為增稠劑、穩定劑、乳化劑、起泡劑和凝膠劑應用于食品、化工和醫藥領域。但是產量低、成本高，菌株穩定性差是影響其廣泛應用的主要因素。影響乳酸菌EPS生物合成的因素很多，而且不同乳酸菌EPS的最適生物合成條件差異較大。乳酸菌EPS生物合成除受遺傳因素即菌株自身因素的影響外，還受培養基的組成、pH，培養溫度、金屬元素(Mg、Mn、Fe)、氨基酸、黃嘌呤和恒定的氧壓濃度等因素的影響[4]。EPS產量的遺傳不穩定性在工業應用上是一個較大的問題，己有研究報道了乳酸菌EPS生產性狀易于丟失、降低或者組成發生改變。

乳酸菌EPS應用于產品的生產成本高要廣泛應用于食品、化工和醫藥領域受到限制。為提高乳酸菌EPS的生物合成量，EPS合成機制、合成的遺傳調控、高產菌株構建、發酵工藝條件優化、新型發酵方法的研究等都是切入點[5]。本文試圖從馬奶酒中分離出的乳酸菌中篩選出合成胞外多糖多的菌種，研究其大量合成胞外多糖的條件、優化發酵工藝，提高胞外多糖的產量，進行后續研究及應用。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗菌株均采于錫林郭勒牧區的巴彥錫勒等牧場，代號分別為：BX、LN、MD、AE、SN、SJ以及本課題組保留的菌株。本課題組在前期工作中將馬奶酒發酵菌初步分離后，菌種凍干保存。

1.2 基礎培養基

TPY液體增菌培養基、MRS固體培養基、MRS半固體培養基、MRS液體培養基及脫脂乳培養基按文獻[6-7]介紹的方法配制。

1.3 方法

1.3.1 胞外多糖高產菌株的篩選及合成條件的研究

將分離保存的41株菌株分別接入MRS液體培養基中，培養24 h后，發酵液采用12000 g 4℃離心30 min，收集上清液，減壓濃縮至適當體積加3倍95%的冷酒精沉淀24 h，于12000 g(4℃)離心30 min，重復3次，沉淀物溶解于重蒸水中，并于4℃下透析24 h，濃縮、真空干燥，并采用硫酸-蒽酮法測定，篩選出合成胞外多糖含量高的菌株鑒定后分別對碳源、氮源和培養條件進行研究，確定最合乳酸菌胞外多糖合成的條件[8]。

1.3.2 分析

光密度采用721分光光度計測定；pH用酸度計測定；總糖含量采用硫酸-蒽酮法測定，以葡萄糖作為標準[9]，活菌數量用MRS瓊脂培養基，培養后進行菌落計數。

2 結果與分析

2.1 馬奶酒中乳酸菌合成胞外多糖能力的研究

2.1.1 高產胞外多糖乳酸菌株的篩選

來源于酸馬奶的不同乳酸菌菌株，在11.5%的脫脂牛乳培養基中，置于37℃培養20 h后，凝乳經過離心、脫蛋白、乙醇沉淀、透析并采用硫酸—蒽酮法測定的EPS生物合成量如表1所示。

表1結果顯示，分離株EPS產量差異顯著，范圍為0.33 mg/L～34.29 mg/L。EPS合成量最高的菌株為標準菌株雙歧桿菌，合成量為34.29 mg/L。除標準菌株外，來源于馬奶酒中的乳酸菌EPS產量最高的菌株是BXE-5-3，其次是 SJR-16-1，其產量是 31.56 mg/L，稍低于BXE-5-3，本項目選取菌株SJR-16-1胞外多糖生物合成條件的研究。

表1 不同乳酸菌株的胞外多糖產量（Mean±SD，n=3）Table1 Exopolysaccharide yield of different strains of lactic acid bacteria

2.1.2 高產EPS菌株的生長曲線

將高產EPS的乳酸菌SJR-16-1接種于裝有MRS液體培養基的試管各14支，37℃培養，每間隔2小時取出1支，在600 nm的波長處檢測光密度。以時間為橫坐標，光密度為縱坐標，得到該菌株的生長曲線如圖1所示。

圖1 菌株SJR-16-1在不同時間培養的生長曲線Fig.1 The growth curve of SJR-16-1 in different times

圖1顯示，乳酸菌SJR-16-1從接種到第4小時處于延遲期，這期間細胞數目變化不大，經過適應后細胞生理狀態逐漸恢復，并開始生長；從第4小時到第10小時為對數期，此期間細胞代謝活躍，生長速度成線性上升，繁殖力強。從第15小時后進入穩定期，在此期間新繁殖細胞數目與死亡的細胞數目基本處于平衡的狀態，活細菌數達到動態平衡。微生物的代謝因種而異，受培養基成分及環境條件的影響，同時與菌齡、接種量也有關系。

2.1.3 高產胞外多糖菌株的鑒定結果

本試驗研究中，對高產EPS乳酸菌菌株SJR-16-1的屬特性鑒定時，采用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)IFO13597為標準菌株。高產菌株SJR-16-1在，在過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗和聯苯胺反應中均為陰性，發酵葡萄糖產酸不產氣，在15℃和45℃都生長的革蘭氏陽性菌鑒定為腸球菌屬的細菌。菌株SJR-16-1除具有乳球菌屬的特征外，在45℃不生長，能在6.5%NaCl環境中生長，能還原0.1%美蘭，能水解精氨酸，能分解棉籽糖，不分解鼠李糖、甘露醇、木糖、松三糖和蜜二糖等糖類的菌鑒定為異腸球菌。具體鑒定結果如表2所示。

表2 乳酸菌SJR-16-1的鑒定結果Table 2 Result of Lactic acid bacteria SJR-16-1 authenticated

2.2 不同碳源碳源對異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成的影響

在初始pH 6.5的基礎液體培養基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源，接種異腸球菌SJR-16-1后置于37℃下發酵24 h，其pH、OD600nm和EPS的生物合成量如表3所示。

表3 不同碳源對異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成量的影響（Mean±SD，n=3）Table 3 Effect of various carbon sources on pH,OD600 and EPS produced by SJR-16-1

結果顯示，在基礎培養基中添加1%葡萄糖和1%麥芽糖，異腸球菌SJR-16-1生長旺盛而且EPS的生物合成量最高為62.68 mg/L。

2.3 不同氮源對異腸球菌SJR-16-1生長和胞外多糖合成的影響

在初始pH 6.5的基礎培養基中，分別加入2%蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白胨，接種異腸球菌SJR-16-1置于37℃下發酵24 h后，其pH、OD變化和EPS的生物合成量如表4所示。

表4結果顯示以蛋白胨作為氮源有利于乳酸菌的增殖和EPS的合成，因此，蛋白胨的添加量分別為20 g/L。

表4 不同氮源對異腸球菌SJR-16-1生長和EPS合成的影響（Mean±SD，n=3）Table4 Effect of various nitrogen sources on pH,OD600 and EPS produced by SJR-16-1

綜合試驗結果和成本考慮，在半合成培養基MRS的基礎上確定的優化培養基組成為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。

2.4 菌株胞外多糖最佳合成條件的研究

為確定異腸球菌SJR-16-1最適生長條件，進一步優化試驗，分別選取pH為A因素，發酵溫度為B因素，發酵時間為C因素，各取4個水平，以胞外多糖產量為指標進行L16（44）正交試驗[8]，因素水平見表5，試驗結果如表6、7所示。

表5 正交試驗設計Table 5 Project of the orthogonal experiment

表6 正交試驗結果Table 6 Result of The orthogonal experiment

由正交試驗和方差結果可知：最優組合為A2B1C1，即溫度30℃，pH6.0，發酵時間14 h，培養時間對結果影響顯著。試驗結果表明較低的培養溫度適合胞外多糖生物合成量的提高。這可能是因為在較低的溫度下，細胞生長慢，細胞壁的合成也慢，從而使較多的磷酸類異戊二烯用于胞外多糖的合成，14 h時合成量達到最大，隨著時間的延長，培養液中乳酸菌的大量生長繁殖，碳源不能滿足微生物生長的需求就會分解部分合成的胞外多糖，導致檢測到的胞外多糖含量降低。由于溫度對結果影響最小，且溫度低乳酸菌繁殖速度慢，菌體少影響胞外多糖的總產量，因此綜合各個方面的條件考慮應選擇的發酵條件為：溫度35℃，pH6.0，發酵時間14 h。

表7 正交試驗的方差分析Table 7 The variance analysis of orthogonal experiment

2.5 優化條件與對照條件的比較結果

在初始pH6.0的優化液體培養基中接種2%的異腸球菌SJR-16-1，置于35℃溫度下發酵14 h，對照組為初始pH6.5液體培養基MRS中接種2%的異場球菌SJR-16-1，置于35℃溫度下發酵14 h測定其活菌數和EPS的產量如圖2所示。

圖2 優化組與對照組的活菌數和EPS的產量比較結果Fig.2 The comparative result of cfu/L and EPS production

從圖2結果可以看出優化培養基菌體數量沒有明顯高于對照組，而且EPS產量大約是對照組的3倍～4倍，顯著提高了EPS的合成量。

3 結論與討論

本項目從內蒙古的馬奶酒中分離的乳酸菌種篩選出一株高產胞外多糖的菌株，經鑒定為異腸球菌。經試驗在半合成培養基MRS的基礎上優化的培養基為蛋白胨2.0%；葡萄糖1.5%；麥芽糖1.5%；K2HPO40.2%；MnSO4·4H2O 0.02%；MgSO4·7H2O 0.02%；醋酸鈉0.5%；酵母粉0.5%；Tween801 mL/L。

接種2%的異腸球菌SJR-16-1于優化培養基中35℃下培養時，初始pH為6.0時發酵14 h后，EPS最大合成量為181.29 mg/L，因此初始pH6.0時35℃是該乳酸菌較為理想的發酵溫度，14 h是該乳酸菌較為理想的發酵時間，并且優化后的條件有利于EPS的合成和積累。

采用優化的培養基和最適的培養條件與對照組相比，EPS的產量有很大的提高，有助于整個研究向產業化方向發展。為了盡量減少MRS液體培養基中存在的大分子物質對多糖測定的影響，試驗中除去了MRS培養基配方中的牛肉膏，優化后培養基對菌株的生長沒有顯著的影響卻可以提高EPS產量，并且還將有利于下一步分離純化EPS。

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Study on the Conditions of Exopolysaccharide Biosynthesis of Enterococcus SJR-16-1

BAI Li-juan1,LI Xiang-dong2
（1.Food Science and Engineering of Liaoning Medical College,Jinzhou 121001,Liaoning,China；2.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Technology Center,Bright Dairy&Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China）

41strains of lactic acid bacterium comed from Kumiss of the pastoral area in Xilin Guole had been examined for its exopolysaccharide production capacities.It was proved that Enterococcus SJR-16-1 was more procreative.The effects of carbon source,nitrogen source,temperature,culture time and optimum initial pH value of medium on exopolysaccharide produced were studied and a new culture medium for the biosynthesis of exopolysaccharide was formulated.The medium had following composition:peptone,2.0%;glucose,1.5%;maltose1.5%;K2HPO40.2%;MnSO4·4H2O,0.02%;MgSO4·7H2O0.02%;Sodium acetace0.5%;yeast0.5%;Tween80,1 mL/L.The best culture conditions for Enterococcus SJR-16-1 to biosynthesis EPS was the constant pH 6.0 of medium with fermentation at 35℃for 14 h.

Enterococcus;exopolysaccharide;biosynthesis

白麗娟（1979—），女（蒙古），講師，碩士，研究方向：食品微生物的研究與利用。

2011-08-01