重組人成纖維細胞生長因子21降糖作用研究

張 健，李婷婷，唐 祿，田海山，，林灼峰，李海燕，王曉杰，，，李校堃， ，

(1.吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林長春 130021;2.溫州醫學院藥學院，浙江

溫州 325035;3.吉林農業大學生命科學學院，吉林長春 130021;4.浙江格魯斯特生物科技有限公司，浙江溫州 325000)

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，rhFGF21)是成纖維細胞生長因子家族中的一員［1］，可與 FGF 受體家族成員中的 1、3、4 結合［2－3］。大量研究證明rhFGF21是和糖脂代謝有關的因子，它可以調控多種內分泌功能［4］。rhFGF21能明顯增加鼠3T3-Ll脂肪細胞及人脂肪細胞對葡萄糖的吸收［5］，但與胰島素的作用機制不同，細胞對葡萄糖的攝取作用既不靠增加外源性肝素調節也不依賴于胰島素，其降血糖作用緩慢持久，大劑量給藥也不會引起低血糖反應。糖尿病是世界上發病率最高的疾病，胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發病的生理基礎之一。研究證明rhFGF21對于胰島β細胞具有保護作用［6］。目前胰島素是治療糖尿病的主要藥物，但是長期使用胰島素會產生胰島素抵抗［7－8］和破壞胰島 β細胞，而 rhFGF21具有調節內分泌和保護胰島β細胞的功能，長期給藥能夠降低血液中胰島素的水平，增強機體對胰島素的敏感性，使其有望成為治療2型糖尿病的備選藥物。本研究通過檢測rhFGF21在細胞水平上及動物模型中對葡萄糖吸收和血糖濃度的影響，初步探討rhFGF21對糖代謝的影響，為研究rhFGF21分子機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、細胞系及動物模型 重組人成纖維細胞生長因子21凍干粉(浙江省生物制藥重點實驗室制備);人肝細胞系(HL-7702);前脂肪細胞系(3T3-L1);大鼠成肌細胞(L6細胞，中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫);ob/ob♂小鼠(南京青紫蘭科技有限公司)

1.1.2 主要試劑及儀器 CO2培養箱(Thermo CELLBB15);胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清、RPMI-1640培養基(Hyclone)、二甲基亞砜 D MSO(GIBCO)，葡萄糖檢測試劑盒(長春匯力生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

1.2.1.1 HL-7702細胞培養 用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37℃、5%CO2條件下培養，隔天換液，細胞融合度達到80%左右，用0.25%的胰蛋白酶消化，備用。

1.2.1.2 L6細胞培養及分化 用完全培養基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基)培養，取對數生長期的細胞接種于12孔板，每孔100 000個細胞，待細胞融合度約70%時，換含2%胎牛血清的高糖DMEM的分化液，直至長出肌管，約14 d左右分化為成熟肌纖維。

1.2.1.3 3T3 L1 細胞培養及分化 用完全培養基(含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基)，在37℃，CO2濃度為5%的培養箱中培養3T3-L1細胞。2 d換1次細胞培養液，在融合度達到80%時接種于24孔板，每孔5 000個細胞，培養48 h后換分化液一(5 ml DMEM完全培養基中含有0.5 mmol·L－1IBMX，胰島素10 mg·L－1)，48 h再換分化液二(5 ml DMEM完全培養基中含有胰島素10 mg·L－1)，培養48 h換5 ml DMEM完全培養基，約8～10 d分化為成熟脂肪細胞。

1.2.2 rhFGF-21誘導HL-7702細胞葡萄糖吸收影響 取對數生長期的HL-7702細胞接種于24孔板中，每孔為 6 00 μl，3.0× 1 04個細胞，于 3 7℃、5%CO2條件下培養24 h，換含1%胎牛血清的 R PMI 1640培養基饑餓培養24 h，更換為1%胎牛血清RPMI 1640培養基稀釋的濃度為200 mg·L－1的RHFGF21，每孔600 μl，3 個復孔，依次 2 倍梯度稀釋，共做7個稀釋濃度。24 h后用葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法檢測培養液中的葡萄糖含量，以未接種細胞空白復孔的葡萄糖均值做參比，測定各孔葡萄糖含量。根據公式:葡萄糖吸收增加量=(空白對照組葡萄糖含量－樣品組葡萄糖含量)/空白對照組葡萄糖含量×100%。

1.2.3 rhFGF21誘導小鼠3T3-L1細胞葡萄糖吸收影響 將分化好的脂肪細胞，用0.5%胎牛血清高糖培養基饑餓24 h，加入梯度濃度的RHFGF21，24、48 h測定葡萄糖含量。

1.2.4 rhFGF21對L6肌細胞葡萄糖吸收的影響12孔板成熟L6肌纖維細胞以含0.5%胎牛血清的高糖DMEM培養基饑餓24 h，換以含0.5%胎牛血清、含不同rhFGF21濃度的培養液，孵育24 h后，用葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法檢測培養液中的葡萄糖含量，以未接種細胞空白復孔的糖含量均值為基礎值，測定各孔葡萄糖吸收量變化。

1.2.5 rhFGF-21對ob/ob小鼠血糖的影響ob/ob小鼠普通飼料飼養;恒溫，恒濕，明暗周期12 h，自由進食飲水;每天上午定時稱體重及飼料消耗。rhFGF21 用量為 0.6 μg·g－1和 2.5 μg·g－1，取 5 只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天 0.6 μg·g－1)連續7 d，分別在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測空腹血糖(生理鹽水組比)。取5只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天0.6 μg·g－1)，連續9 d，末次給藥后1 h開始口服糖耐量實驗(空腹2 h，測0 min血糖，灌胃給予2 mg·g－1的葡萄糖溶液，分別于給予葡萄糖溶液后30、60、120 min檢測血糖)。取5只ob/ob小鼠，皮下注射 rhFGF21(每天 2.5 μg·g－1)連續7 d，在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測餐后血糖。

1.2.6 統計學處理 上述細胞實驗均重復3次，取其均值，采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析，定量數據以±s表示。

2 結果

2.1 rhFGF21促進HL-7702細胞葡萄糖吸收rhFGF21處理 HL-7702細胞后，在3.9 mg·L－1～100 mg·L－1間rhFGF21促進HL-7702細胞葡萄糖的吸收且呈現濃度－效應關系，EC50值為18.8 mg·L－1，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)(見Fig 1)。

2.2 rhFGF21促進3T3-L1細胞葡萄糖吸收 rh-FGF21作用于脂肪細胞結果提示，在12.6 mg·L－1～100 mg·L－1間rhFGF21促進分化的3T3-L1細胞葡萄糖的吸收且呈現濃度－效應關系，EC50值為39.5 mg·L－1，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)(見 Fig 2)。

Fig 2 Effect of rhFGF21 on glucose uptake in differentiated 3T3-L1 cells

2.3 rhFGF21促進L6細胞葡萄糖吸收 rhFGF21從0.3mg·L－1到 250 mg·L－1可促進 L6 肌細胞對葡萄糖的消耗，EC50值為58.5 mg·L－1，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，呈現濃度－效應關系(見Fig 3)。

2.4 rhFGF-21對ob/ob♂小鼠空腹血糖的作用rhFGF-21按照每天0.6 μg·g－1的劑量頸部皮下注射連續7 d，分別在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測血糖。如圖顯示，與生理鹽水組比，給FGF-21后3 d、7 d，血糖呈降低趨勢，但差異未達統計學意義(見Fig 4)。

Fig 3 Effect of rhFGF21 on glucose uptake in L6 cells

Fig 4 Effect of rhFGF21 on fasting blood glucose of ob/ob male mice

2.5 rhFGF-21改善ob/ob♂小鼠糖耐量 皮下注射 rhFGF-21(每天 0.6 μg·g－1)，連續 9 d，末次給藥后1 h開始OGTT。如圖顯示，FGF-21(每天0.6 μg·g－1)對ob/ob小鼠的糖耐量有一定的改善作用(見 Fig 5)。

Fig 5 Effect of rhFGF21 on OGTT blood glucose of ob/ob mice

2.6 rhFGF-21對ob/ob♂小鼠餐后血糖的作用FGF-21按照每天2.5 mg·g－1的劑量頸部皮下注射連續7 d，在d 0、d 3、d 7給藥后1 h檢測餐后血糖。給藥后3 d，血糖有所下降，P=0.051。給藥后7 d，產生明顯的降血糖作用(P＜0.05)，見Fig 6。

Fig 6 Effect of FGF-21(2.5 μg·g －1)on postprandial blood glucose of ob/ob mice

3 討論

成纖維細胞生長因子-21(rhFGF21)是成纖維細胞生長因子家族的一個新成員，最早是從小鼠胚胎中分離出來的一種可分泌蛋白;成年小鼠rhFGF21的mRNA在肝臟內大量表達，在胸腺中低水平表達，而在其他組織中尚未發現。人類的FGF21氨基酸序列與FGF19和FGF23較為相近，其同源性分別為35%和24%。因此，FGF21、FGF19和FGF23被歸類為FGFs家族的一個亞家族。由于這個亞家族成員與糖脂代謝有著密切的關系，所以近年來在國際上成為糖尿病和肥胖等代謝疾病研究的熱點基因，其中人們最為關注FGF21。FGF21與其他FGF家族不同，不與肝素結合 ，也不會促進細胞分裂作用。美國Lilly公司已經開展FGF21用于糖尿病治療藥物的開發，目前正處在Ⅱ期臨床階段。本課題組利用基因工程分泌表達技術已經獲得rhFGF21純品，為FGF21新藥研究奠定了良好基礎。

基因工程重組蛋白的生物學活性是反映藥物質量及功效的重要指標，因此建立穩定、靈敏的活性測定方法對于產品的生產及質量檢測具有重要意義，同時也是指導臨床用藥劑量重要的指標。在過去的實驗報道中大多數選擇3T3-L1脂肪細胞作為檢測葡萄糖吸收的細胞模型，該方法需要高糖誘導，低糖分化，將前脂肪細胞3T3-L1分化成脂肪細胞，再用rhFGF21刺激3T3-L1細胞。該方法造膜較難，試驗周期長，結果重現性較差。本實驗同時選用人肝細胞系(HL-7702);前脂肪細胞系(3T3-L1);大鼠成肌細胞(L6細胞)進行葡萄糖吸收試驗，旨在確定作為rhFGF21活性檢測用細胞株，并進一步確證rhFGF21體外降糖［9－10］效果及其作用的靶器官。實驗結果表明rhFGF21可有效調控3種細胞模型的葡萄糖吸收，在肝細胞模型中，在3.9 mg·L－1～100 mg·L－1之間，rhFGF21促進HL-7702細胞葡萄糖的吸收且呈現濃度－效應關系，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05);在大鼠成肌細胞模型中，在0.3 mg·L－1～250 mg·L－1之間，rhFGF21 促進 L6 肌細胞對葡萄糖的消耗，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05);在脂肪細胞模型中，在12.6 mg·L－1～100 mg·L－1之間，rhFGF21促進分化的3T3-L1細胞對葡萄糖的吸收［5］且呈現濃度－效應關系，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05);ob/ob小鼠血糖實驗證明，rhFGF-21可降低ob/ob鼠空腹及餐后血糖，同時改善葡萄糖耐受量。本實驗結果表明，rhFGF21對肝細胞，脂肪細胞，骨骼肌細胞均具有促進葡萄糖吸收的作用，肝細胞，脂肪細胞，骨骼肌細胞是rhFGF21作用的靶器官，同時，動物實驗進一步確證了rhFGF21降低血糖，改善葡萄糖耐受量的作用，本實驗對于開展rhFGF21藥效學實驗及改善葡萄糖吸收機制研究起到積極的借鑒作用。

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