高脂乳對大鼠神經炎癥的產生及其機制的初步研究

何 鑫，胡金鳳，楚世峰，齊孟和，3，吳苗苗，陳乃宏

(1.天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050;2.天津中醫藥大學，天津 300193;3.內蒙古醫學院，呼和浩特 010059)

炎癥是一個對外來入侵(如壓力、外傷、感染等)進行復雜的細胞及分子應激并試圖抵抗這種入侵的過程［1］。神經系統發生的炎癥反應(神經炎癥)是腦中小膠質細胞、星形膠質細胞的激活并使得細胞因子、趨化因子、神經遞質和氧自由基(ROS)等炎癥介質釋放的過程［2］。神經炎癥的發生與神經退行性疾病的發生密切相關。神經退行性疾病包括阿爾采末病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮，tauopathies、年齡相關的黃斑退化等，研究表明［3］，在這些疾病的病理現象中均觀察到神經炎癥的發生。

大量的研究報道稱現今社會的發展致使人們飲食結構發生改變，高脂飲食充斥人們的生活。流行病學調查發現，大量的攝入膽固醇及脂肪使得高脂血癥頻發，進而引起其它的病變如肥胖癥、腦血栓、冠心病、脂肪肝、高血壓、糖尿病、腦卒中及一些神經退行性疾病等［4］。并且，高脂飲食導致的神經系統疾病伴隨著神經炎癥的發生，也有很多研究者對此進行了大量的實驗研究，但是所采用的高脂飲食模型的造模方法均是通過給予高脂飼料進行飼養［5－7］，該方法是由動物自由攝取高脂飼料，其攝入量不可控，從而使得動物模型組內差異較大。而如若定量通過灌胃給予高脂乳，動物攝取脂肪及膽固醇的量變為可控的，可縮小動物組內差異，而使模型較穩定。所以本文致力于定量給予高脂乳造模研究其對神經炎癥的激發及相關機制。

1 方法

1.1 動物及分組 SD大鼠，30只，♂，體質量240～270 g;北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK(京)2009-0017］。

1.2 造模方法 大鼠隨機分為空白組、模型組，每組15只。空白組灌胃給水，1 ml/100 g，模型組灌胃給予高脂乳(高脂乳配方:油相－豬油100 g，膽固醇40 g，膽酸鈉 4 g;水相－水 120 ml，丙二醇 80 ml，吐溫-80 100 ml，丙硫氧嘧啶 4 g)，1 ml/100 g，兩組自由飲食飲水，造模2個月。

1.3 Western blot分析蛋白表達及磷酸化水平大鼠斷頭取腦后，冰上分離海馬、皮層、紋狀體。按100 g·L－1的稀釋比例，用組織勻漿器勻漿，勻漿液4℃，12 000×g離心20 min，收集上清。采用 BCA定量試劑盒進行蛋白定量后，加入上樣緩沖液煮沸變性。蛋白樣品經12%SDS-PAGE膠分離后轉移至PVDF膜上，3%BSA室溫封閉2h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗滌3次后加上HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，再經TBS-Tween洗滌3次后加上ECL發光液進行檢測。

1.4 ELISA法檢測炎癥因子含量 海馬、皮層、紋狀體組織勻漿同上。勻漿液4℃，12 000×g離心10 min，收集上清。按照大鼠ELISA試劑盒操作說明測定腦勻漿液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。

Fig 1 Expression of OX42 and GFAP in hippocampus，cortex and striatum of rats fed on high-fat dairy is determined by Western blot(n=5)

1.5 免疫組織化學觀察星形膠質細胞的激活 造模結束后，10%水合氯醛350 mg·kg－1腹腔麻醉大鼠。4%多聚甲醛經心臟灌流，取腦置于甲醛溶液中固定24小時后，石蠟包埋、切片(片厚8 μm)。石蠟切片常規脫蠟至水，92℃枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中抗原熱修復10 min，室溫冷卻30 min，加入3%雙氧水室溫作用10 min以消除內源性過氧化物酶活性，非特異性位點用羊血清室溫封閉15 min。加一抗GFAP稀釋液(1∶50)4℃過夜，加生物素標記二抗37℃孵育1 h，再加三抗37℃孵育1 h。DAB顯色，雙蒸水終止反應。常規脫水至透明，中性樹膠封片。采用正置顯微鏡觀察膠質細胞在不同部位的表達情況。

2 結果

2.1 高脂乳對小膠質細胞和星形膠質細胞的活性的影響 OX42、GFAP分別是小膠質細胞及星形膠質細胞特異性標記物，本實驗采用Western blot檢測了高脂乳對這兩種蛋白表達的影響，進而確定高脂乳對神經炎癥細胞激活的影響。實驗結果如Fig 1所示，與空白組相比，高脂飲食可明顯增加大鼠腦海馬、皮層、紋狀體OX42、GFAP表達量，表明高脂乳可激活小膠質細胞和星形膠質細胞。Fig 2實驗結果表明，高脂乳可使星形膠質細胞形態發生改變:細胞膨脹、肥大，突起變長，表明星形膠質細胞被激活。

Fig 2 Immunohistochemical analysis of GFAP expression in hippocampus and cortex of rats fed on high-fat dairy

2.2 高脂乳對炎癥因子產生及COX2表達的影響ELISA試劑盒檢測結果表明，高脂乳能使大鼠海馬、皮層、紋狀體產生的炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量與空白組比明顯增加(Fig 3)。并且，COX2在炎性因子刺激下可被激活，高脂乳能使大鼠腦的海馬、皮層、紋狀體的COX2的表達量明顯增加(Fig 4)，提示COX2被激活。

Fig 3 Effect of high-fat dairy on the content of TNF-α and IL-1β in hippocampus，cortex and striatum of rats detected by ELISA kits(n=5)

2.3 高乳脂對MAPKs表達的影響 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是廣泛表達的絲氨酸/酪氨酸激酶，包括3個主要家族:ERKs、JNKs和p38 MAPKs，研究表明，其在炎癥、細胞應激、凋亡、細胞周期和生長等多種生理和病理過程中起重要作用。我們的研究發現，高脂乳可使大鼠腦海馬、皮層、紋狀體的p38、JNK、ERK磷酸化水平與空白組比增加，但其表達量無改變(Fig 4)，提示MAPK可能參與高脂乳激活的神經炎癥過程。

3 討論

本實驗研究了高脂乳對SD大鼠腦海馬、皮層、紋狀體內神經炎癥的激活情況，結果表明，高脂乳能夠激活上述部位的小膠質細胞和星形膠質細胞，使TNF-α和IL-1β的產生增加，COX-2表達增加，引發腦內炎癥，作用機制可能與激活了MAPK信號通路有關。

高脂飲食損傷中樞神經系統已得以確定，但其致病機制尚不明確。近年很多研究報道高脂飲食引發神經系統疾病可能是由于它激活神經炎癥而導致的。而定量給予高脂乳，模型可控、較穩定。并且高脂乳所致動物腦內炎癥未見報道，所以本實驗對高脂乳所致神經炎癥的激活進行了研究。實驗結果表明，高脂乳可增加海馬、皮層、紋狀體內神經炎癥細胞——小膠質細胞和星形膠質細胞的標記物表達量，使TNF-α和 IL-1β的產生增加，COX-2表達增加，從而證實高脂乳也可激活腦部神經炎癥。

小膠質細胞和星形膠質細胞均屬于神經膠質細胞，是參與腦內炎癥反應的主要免疫細胞。小膠質細胞的激活表現在形態和功能改變兩方面，形態觀察可見起激活時胞體腫脹、突起增長，功能改變即在激活時會大量分泌不同的免疫調節肽，如細胞活素類(TNF-α和IL-1β)、趨化因子及一些非特異性的炎癥因子［8］。星形膠質細胞被激活后細胞腫脹，并大量增生，產生炎性蛋白(COX2)及炎性因子［9］。本實驗研究發現，高脂飲食可增加小膠質細胞標記蛋白OX42以及星形膠質標記物GFAP，而且免疫組化結果也顯示，星形膠質細胞膨脹、肥大，突起變長，表明這兩種炎癥細胞被激活。COX2是催化花生四烯酸合成PGE2過程中的限速酶，據報道COX2與炎癥反應密切相關［10］。本實驗研究發現高脂乳促進COX2蛋白表達，提示高脂乳可能通過促進COX2表達，進而促進PGE2合成而發揮神經炎癥作用，但其對COX2酶活性有無影響有待于進一步研究。

MAPK是介導細胞反應的重要信號系統，參與介導細胞生長、發育、分裂、分化、死亡以及細胞間的功能同步等多種細胞過程。經典的MAPK主要包括ERK、JNK、p38三個亞族，近年來也發現另一亞族ERK5/BMK1。激活的MAPK可通過磷酸化轉錄因子、細胞骨架相關蛋白、酶類等多種底物來調節多種細胞生理過程［11］。研究也發現，MAPK能被多種炎性刺激所激活，在介導炎癥反應和細胞因子生成中起著重要的作用，表明其對炎癥的發生、發展起重要調控作用［12］。我們的研究表明，在小膠質細胞、星形膠質細胞激活產生神經炎癥的部位——海馬、皮層、紋狀體，也觀察到 ERK、p38、JNK通路的激活，提示MAPK通路的激活可能參與高脂乳所致的神經炎癥反應過程。

總之，本研究對高脂乳導致神經系統退行性疾病的作用機制進行了初步研究，證實了高脂乳可能通過激活MAPK途徑介導神經炎癥的發生、發展，這為闡釋高脂飲食所致神經退行性疾病提供了理論依據。

Fig 4 Expression of high-fat dairy on the expression of COX2，ERK，JNK and p38 MAPK and the phosphorylation of MAPK in hippocampus，cortex and striatum of rats determined by Western Blot(n=5)

［1］Infante-Duarte C，Waiczies S，Wuerfel J，et al.New developments in understanding and treating neuroinflammation［J］.J Mol Med，2008，86(9):975－85.

［2］Young-Jung L，Sang Bae H，Sang-Yoon N，et al.Inflammation and Alzheimer’s Disease［J］.Arch Pharmacal Res，2010，33(10):1539－56.

［3］Choi D K，Koppula S，Choi M，et al.Recent developments in the inhibitors of neuroinflammation and neurodegeneration:inflammatory oxidative enzymes as a drug target［J］.Expert Opin Ther Pat，2011，20(11):1531－46.

［4］Freeman L R，Haley-Zitlin V，Stevens C，et al.Diet-induced effects on neuronal and glial elements in the middle-aged rat hippocampus［J］.Nutrit Neurosci，2011，14(1):32－44.

［5］Thirumangalakudi L，Prakasam A，Zhang R，et al.High cholesterolinduced neuroinflammation and amyloid precursor protein processing correlate with loss of working memory in mice［J］.J Neurochem，2008，106(1):475－85.

［6］Nerurkar P V，Johns L M，Buesa L M，et al.Momordica charantia(bitter melon)attenuates high-fat diet-associated oxidative stress and neuroinflammation［J］.Neuroinflammation，2011，8(64):1－19.

［7］Granholm A C，Bimonte-Nelson H A，Moore A B，et al.Effects of a saturated fat and high cholesterol diet on memory and hippocampal morphology in the middle-aged rat［J］.J Alzheimers Dis，2008，14(2):133－45.

［8］Zhang F，Liu J，Shi J S.Anti-inflammatory activities of resveratrol in the brain:Role of resveratrol in microglial activation［J］.Eur J Pharmacol，2010，636(2010):1－7.

［9］Rossi D，Volterra A.Astrocytic dysfunction:Insights on the role in neurodegeneration［J］.Brain Res Bull，2009，80(2009):224－32.

［10］Cimino P J，Sokal I，Leverenz J.DOCK2 is a microglial specific regulator of central nervous system innate immunity found in normal and alzheimer’s disease brain［J］.Am J Pathol，2009，175(4):1622－30.

［11］趙秀鶴.MAPK信號轉導途徑及其在神經系統疾病中作用的研究進展［J］.國外醫學神經病學神經外科學分冊，2005，32(3):248－51.

［11］Zhao X H.MAPK signal transduction pathway and its role in nervous system disease research progress［J］.Foreign Medical Sciences(Section on Neurology＆Neurosurgery)，2005，32(3):248－51.

［12］劉智良，羅成義.MAPK信號轉導的現況及在腦創傷中的應用［J］.中國臨床神經外科雜志，2001，6(1):60－1.

［12］Liu Z L，Luo C H.The current status of the MAPK signal transduction pathway in traumatic brain injury［J］.Chin J Clinical Neurosurgery，2001，6(1):60－61.