硝酸鑭對小鼠特異性抗體的形成、淋巴細胞轉化和腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

宋 宇，黃可欣，李冬梅，石 搏

（1.吉林大學白求恩醫學院形態學實驗中心，吉林長春130021；2.長春大學特殊教育學院，吉林 長春130022）

硝酸鑭對小鼠特異性抗體的形成、淋巴細胞轉化和腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

宋 宇1，2，黃可欣1，李冬梅2，石 搏1

（1.吉林大學白求恩醫學院形態學實驗中心，吉林長春130021；2.長春大學特殊教育學院，吉林 長春130022）

目的：觀察硝酸鑭作用后小鼠特異性抗體的形成、淋巴細胞轉化及腹腔巨噬細胞吞噬功能的變化，探討硝酸鑭對小鼠免疫功能的影響。方法：昆明種小鼠60只，隨機分為對照組、硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·Kg－1組，每組10只，分別給予小鼠腹腔注射生理鹽水、硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－11次；應用直接凝集法、3H－Td R摻入放射自顯影術和吞噬雞紅細胞法，檢測硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體的效價、被標記淋巴細胞轉化比值和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的比值。結果：與對照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1組小鼠抗A抗體的效價、被標記淋巴細胞轉化比值和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值均顯著升高（P＜0.01）；與對照組、酸硝鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1組比較，酸硝鑭10.0和20.0 mg·kg－1組小鼠抗A抗體的效價、被標記淋巴細胞轉化比值和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值顯著降低（P＜0.01）。結論：小劑量硝酸鑭對小鼠特異性抗體的形成、淋巴細胞轉化及腹腔巨噬細胞吞噬功能具有明顯促進作用，大劑量硝酸鑭則具有明顯的抑制作用。

硝酸鑭；抗A抗體 ；放射自顯影術 ；巨噬細胞

稀土元素共有17種，其中15種為鑭系。鑭系稀土元素具有許多優良的理化性質，被廣泛應用于各行各業，因而導致了越來越多的稀土元素進入生物賴以生存的環境中，近年來很多報道已證實稀土元素可以通過食物鏈、呼吸道和皮膚等多種途徑進入生物體內，并通過血液運輸滯留或蓄積在各臟器組織內［1－3］。稀土元素對生態環境和人體健康的影響以及關于稀土元素近期及遠期生物學效應的研究越來越引起人們的關注，大量的國內外研究報道［4－6］已證實：稀土是一類低毒性物質，適量攝入對機體心臟、肝臟、脾臟和血清激素等方面有良好的保護作用，而大量攝入則會對機體造成危害。鑭元素在稀土元素中的應用較為廣泛，一般常以化合物如氯化鑭、硝酸鑭形式存在，但目前國內外尚未見關于硝酸鑭對小鼠免疫功能影響的相關報道。本研究探討不同劑量硝酸鑭對小鼠特異性抗體的形成、淋巴細胞轉化和腹腔巨噬細胞吞噬功能影響，旨在證實低劑量硝酸鑭對免疫功能的作用，為稀土元素應用于臨床以及預防保健提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 采用60只健康雄性昆明種小鼠，均為3周齡，體質量（15.48±1.42）g，由吉林大學醫學實驗動物中心提供。硝酸鑭由北京稀土農用中心提供，3H－TdR購于北京原子能研究所，力豆蛋白（Con A）、低糖營養液（IMDM）、小牛血清購于四季青生物工程公司。

1.2 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為6組，每組10只。第1組為對照組，第2～6組依次為硝酸鑭0.1、0.2、2.0、10.0和20.0 mg·kg－1組。動物進行免疫之前做以下處理：對照組小鼠經腹腔注射生理鹽水0.1 mL，第2～6組小鼠經腹腔注射硝酸鑭（0.1、0.2、2.0、10.0 和 20.0 mg · kg－1）0.1 mL；各組小鼠每隔10 d注射1次，共注射3次。

1.3 動物免疫 各組小鼠經上述處理后，于次日取5個A型血人的混合新鮮血，用生理鹽水洗3次后，按紅細胞壓積用生理鹽水稀釋10倍，制成紅細胞懸液，經腹腔注射免疫；每隔10 d免疫1次，第3次免疫后10 d再加強免疫1次，3 d后進行后續實驗。

1.4 抗體效價的測定 應用直接凝集法［7］測定抗體效價。首先稀釋待檢血清：取10支試管排列于試管架上，依次編號，用吸管在每管加入生理鹽水，第1管加入0.9 m L，其余各管均加入0.5 m L。后吸取0.1 m L待檢血清加入第1管內，吸入稀釋液，再行吹出，重復3次，使混勻，該管含1∶10稀釋血清。接著用同一吸管從第1管吸出0.5 m L加入第2管內，按上法混合，并以同法連續稀釋至第9管，從該管內吸取0.5 m L棄去。如此每管內所含受檢血清濃度為前一管的一半，即1∶10、1∶20、1∶40……，最后一管留作對照；其次加入抗原：每排各管加入診斷菌液0.5 m L，振搖試管架，充分混勻。此時血清的最終稀釋倍數，從第1管開始，分別為1∶20、1∶40……末管為抗原對照；保溫靜置：37℃靜置2 h，初步判讀結果，然后移放冰箱過夜，再次判讀。

1.5 被標記轉化淋巴細胞比值檢測 應用3H－Td R摻入放射自顯影術。脫臼處死小鼠，取其脾臟在無菌條件下制成細胞懸液，營養液為含10%小牛血清、Con A的IMDM；將脾細胞懸液接種于96孔培養板，于37℃、5%CO2溫箱靜置48 h后，加入3H－Td R，至終濃度為1 mCi·L－1，繼續培養12 h后制成涂片標本，于暗室內紅燈下涂核乳膠，放入暗盒中于4℃曝光，經顯影、定影及HE染色后顯微鏡下觀察。

1.6 巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 應用吞噬雞紅細胞法［8］，即實驗結束后將雞紅細胞注入小鼠腹腔，2 h后抽出腹腔液體置于干凈的載玻片上，以95%酒精固定15 min，HE染色光學顯微鏡觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的情況。

1.7 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。抗A抗體效價、被標記淋巴細胞轉化比值、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值均以±s表示，多個樣本均數組間比較采用方差分析。

2 結 果

與對照組比較，小鼠抗A抗體效價在硝酸鑭0.1、0.2 和 2.0 mg·kg－1劑 量 組 升 高（P＜0.05），尤 以 0.1、0.2 mg·kg－1組 明 顯；而 在10.0和20.0 mg·kg－1組降低（P＜0.01）。脾細胞懸液標本可見大型淋巴細胞均為轉化淋巴細胞，部分轉化淋巴細胞核內有黑色銀顆粒，即為被標記轉化的淋巴細胞。依次計數500個細胞，與對照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組轉化淋巴細胞比值升高（P＜0.05），尤以 0.1、0.2 mg·kg－1組明顯（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1組轉化淋巴比值降低，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。對照組標本可見散在巨噬細胞、雞紅細胞，有少數巨噬細胞吞噬數個雞紅細胞；硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組標本可見大量巨噬細胞吞噬大量雞紅細胞，與對照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值升高（P＜0.01），尤以0.1、0.2組明顯（P＜0.01）；而在10.0和20.0 mg·kg－1組腹腔巨噬細胞吞噬細胞雞紅細胞比值降低，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體效價、3 H－Td R標記轉化淋巴細胞比值和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

表1 硝酸鑭作用后小鼠抗A抗體效價、3 H－Td R標記轉化淋巴細胞比值和腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞比值Tab.1 The anti－A antibody titer，the 3 H－TdR marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice after treated with La（NO3）3 （n＝10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group；＃P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 group；△P＜0.01 compared with La（NO3）3 0.2 mg·kg－1 group；▲P＜0.01 compared with La（NO3）3 2.0 mg·kg－1 group.

Group Antibody titer Marked lymphocyte transformation ratio（η／%）Ratio of chicken erythrocytes（η／%）Control 2.196±0.211 70.430±0.135 53.360±0.021 La（NO3）3 0.1 mg·kg－1 2.932±0.091＊ 94.310±0.011＊＊ 99.810±0.032＊＊0.2 mg·kg－1 2.899±0.132＊ 93.260±0.112＊＊ 98.740±0.017＊＊2.0 mg·kg－1 2.741±0.203＊ 90.640±0.146＊ 95.490±0.025＊10.0 mg·kg－1 1.821±0.214＊＊＃△▲ 51.220±0.097＊＊＃△▲ 40.390±0.036＊＊＃△▲20.0 mg·kg－1 1.722±0.163＊＊＃△▲ 41.390±0.137＊＊＃△▲ 35.580±0.041＊＊＃△▲

3 討 論

近年來，隨著對稀土化合物生物效應研究的深入，稀土元素在農業及醫藥領域具有廣泛的應用前景，因此其安全劑量的確定就顯得尤其重要［9－11］。國內學者［12－13］報道：小劑量硝酸鑭對脾臟的免疫功能有促進作用，大劑量硝酸鑭有抑制作用，這是對機體自身免疫功能調節的證實。機體的免疫系統是由具有免疫功能的器官、組織、細胞和分子組成的，是機體免疫反應發生的物質基礎。臟器指數是衡量機體免疫功能的初步指標，以T和B細胞介導的細胞免疫和體液免疫是反映機體免疫調節平衡狀態的重要參數，單核巨噬細胞的吞噬能力可衡量機體非特異性免疫功能。因此，本研究主要從特異性免疫及非特異性免疫功能方面評價硝酸鑭對機體免疫功能的調節作用。本實驗應用人A型紅細胞免疫小鼠后，刺激B淋巴細胞，經增殖、分化成為具有合成與分泌抗A抗體的漿細胞。檢測小鼠血清中抗A抗體效價可以看出，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組對抗A抗體形成有促進作用，尤以0.1和0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組有抑制作用，說明小劑量的硝酸鑭具有刺激B淋巴細胞母細胞化、增殖及分化為漿細胞的功能，而大劑量則有抑制作用［7－8］。3H－TdR摻入放射自顯影術檢測結果表明：La（NO3）3在0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組對淋巴細胞轉化具有促進作用，尤以0.1、0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組有抑制作用［9－10］。吞噬功能實驗結果表明：硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組標本可見大量巨噬細胞吞噬大量雞紅細胞，與對照組比較，硝酸鑭0.1、0.2和2.0 mg·kg－1劑量組吞噬功能增強，尤以0.1和0.2 mg·kg－1組明顯；而在10.0和20.0 mg·kg－1組標本可見極少量吞噬現象，與對照組比較，其吞噬功能減弱。上述實驗通過外源性刺激進一步證實小劑量硝酸鑭對機體免疫功能有促進作用而大劑量硝酸鑭對機體免疫功能有抑制作用。本實驗結果表明：硝酸鑭對小鼠的免疫功能有一定的調節作用，具體的免疫調節機制有待于進一步研究。

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Effects of La（NO3）3on formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytic function in mice

SONG Yu1，2，HUANG Ke－xin1，LI Dong－mei2，SHI Bo1
（1.Morphology Experiment Center，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.School of Special Education，Changchun University，Changchun 130022，China）

Objective To observe the changes of the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and peritoneal macrophage phagocytotic function in mice after treated with La（NO3）3，and to explore the effect of La（NO3）3on immune function in mice.Methods 60 Kunming mice were randomly divided into control group，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0 and 20.0 mg·kg－1groups，there were 10 mice in each group，and the mice in various groups were given intraperitoneal injection of saline，La（NO3）30.1，0.2，2.0，10.0，and 20.0 mg·kg－1once a day.Direct agglutination，3H－TdR incorporation radiation self－developing technique and phagocytic chicken erythrocytes were used to detect the anti－A－antibody titer，marked lymphocyte transformation ratio and ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages after treated with La（NO3）3.Results Compared with control group，the anti－A antibody titer，the marked lymphocyte transformation ratio and the ratio of chicken erythrocytes phagocytized by peritoneal macrophages of mice in La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups were increased significantly（P＜0.01）；compared with control，La（NO3）30.1，0.2 and 2.0 groups，those indexes mentioned above in La（NO3）310.0 and 20.0 mg·kg－1groups were decreased significantly（P＜0.01）.Conclusion Small doses of La（NO3）3can promote the formation of specific antibodies，lymphocyte transformation and phagocytic function of peritoneal macrophages and large doses of La（NO3）3have significantly inhibitory effects in mice.

La（NO3）3；anti－A antibody；autoradiography；macrophages

R392.12

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1048－04

2012－06－22

國家自然科學基金資助課題（29890208）

宋 宇（1970－），男，吉林省長春市人，講師，醫學碩士，主要從事稀土生物學效應的研究。

黃可欣（Tel：0431－85619734，E－mail：huangkx＠jlu.edu.cn）

時間：2012－10－2509：34

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20121025.0934.002.html