紅景天苷與骨髓間充質干細胞聯合應用對帕金森病大鼠的治療作用

范東艷，王 蘋，陳玉丙

（1.西藏大學醫學院預防醫學系，西藏 拉薩850000；2.吉林大學第一醫院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春130021；3.吉林大學第二醫院核醫學科，吉林 長春130041）

紅景天苷與骨髓間充質干細胞聯合應用對帕金森病大鼠的治療作用

范東艷1，王 蘋2，陳玉丙3

（1.西藏大學醫學院預防醫學系，西藏 拉薩850000；2.吉林大學第一醫院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長春130021；3.吉林大學第二醫院核醫學科，吉林 長春130041）

目的：研究紅景天苷與骨髓間充質干細胞（BMSCs）聯合應用對帕金森病（PD）大鼠的治療作用，為PD治療提供實驗基礎。方法：采用貼壁法培養BMSCs，免疫熒光法檢測細胞表面分子。利用MTT法分析10 mg·L－1紅景天苷對BMSCs增殖分化的影響。將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、紅景天苷治療組、BMSCs治療組、紅景天苷和BMSCs聯合治療組，每組12只。在相對應的時間點檢測各組大鼠行為學變化，取各組大鼠腦組織測定酪氨酸羥化酶（TH）m RNA表達水平。結果：成功分離提取表達干細胞標志物CD29和CD44細胞。紅景天苷作用BMSCs后，BMSCs增殖較對照組更為旺盛且平臺期較對照組延長。PD模型組大鼠旋轉次數減少，與其他組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠行為改變明顯，腦組織內TH m RNA表達水平降低。紅景天苷和BMSCs聯合治療組大鼠行為學異常程度較輕，腦組織內TH mRNA表達水平高于其他組（P＜0.05）。結論：紅景天苷與BMSCs聯合應用對PD大鼠的治療作用優于單獨應用紅景天苷或BMSCs。

紅景天苷；骨髓間充質干細胞；帕金森病

紅景天苷是紅景天發揮作用的主要有效成分，可通過清除自由基、抑制鈣超載和抑制膽堿酯酶活性等作用預防神經細胞功能衰退，維持血腦屏障結構 正 常［1－4］。 骨 髓 間 充 質 干 細 胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化潛能的多能干細胞，在一定的條件下可以誘導分化為神經細胞，并可分泌多種神經營養因子，通過多種途徑修復組織損傷，且BMSCs在腦內能長期存活［5］，因此在治療神經系統疾病方面具有廣闊前景。雖然紅景天苷與BMSCs均能在一定程度上保護神經細胞免受傷害，但單獨使用均有一定的局限性，二者聯合應用可能會發揮更好的治療作用，達到單一細胞或單一藥物無法達到的效果。有關紅景天苷和BMSCs聯合應用治療帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的研究國內外未見報道。本研究聯合應用紅景天苷和BMSCs治療PD，充分發揮二者治療的相加作用，旨在為今后藥物與細胞移植聯合應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 Wistar大鼠60只，體質量180～200 g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK－（吉）2007－0003。紅景天苷購自中國藥品生物制品檢定所；DMEM／F12、胎牛血清和胰蛋白酶均購自Gibco公司；MTT、碘化丙啶、多聚甲醛、二甲基亞砜、酪氨酸羥化酶（tyrosin hydroxylase，TH）單克隆一抗和阿樸嗎啡（apomorphine）均購自Sigma公司；鼠抗CD29、鼠抗CD44和羊抗鼠FITC均購自Chemicon公司；羊血清購自中杉金橋公司。MK3型酶標儀購自Labsystem公司；熒光倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.2 BMSCs的分離和體外擴增 將大鼠脫臼處死；無菌取出雙側股骨、肱骨，暴露干骺端，用L－DMEM沖洗骨髓置入30 m L離心管；1000 r·min－1離心5 min；輕柔吹打細胞團，以106m L－1細胞接種于完全培養基內（L－DMEM培養基＋15%胎牛血清＋100 U·m L－1青霉素和100 U·m L－1鏈霉素）；細胞培養于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內。72 h后更換培養基。待細胞長到80%融合時用0.25%的胰酶消化傳代，擴增。采用及時、反復傳代法對細胞進行純化。

1.3 BMSCs表型鑒定 將第3代的BMSCs種植于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS洗3次，每次5 min；加入5%封閉血清－0.3%Trito 100－PBS，37℃封閉30 min；加一抗：鼠抗CD29（1∶50）、CD44（1∶50）。陰性對照加入PBS，置濕盒內，4℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；加入FITC羊抗鼠IgG（1∶100）37℃孵育l h；PBS洗3次，每次5 min；PI復染細胞核，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。熒光標記細胞核為紅色，細胞漿表達產物為綠色。

1.4 MTT法檢測細胞增殖能力 體外實驗部分分為2組，實驗組加入10 mg·L－1紅景天苷［6］作用BMSCs，對照組不給藥；取第3代BMSCs調整密度為1×105m L－1，分別接種于96孔板內；每板2組（實驗組和對照組），一共接種7塊板，每天取1塊板采用MTT法檢測細胞增殖。MTT法：細胞貼壁1 d后，棄培養基，每孔加入20μL MTT，培養箱內孵育4 h，之后加入二甲基亞砜，每孔200μL，用酶標儀在590 nm波長下測定各孔A值。細胞增殖抑制率＝［1－（實驗孔A值－空白孔A值）／（對照孔A值－空白孔A值）］×100%。分別于1～7 d相同時間點進行檢測。

1.5 模型動物制備及行為學檢測 Wistar大鼠術前進行行為學測試，確定無異常旋轉行為。用10%水合氯醛（3 m L·kg－1）腹腔注射，睫毛反射消失后，將大鼠腹臥位固定于立體定位儀上，參照Paxinos and Watson的 《The Rat Brain Atlas》圖譜，常規去毛消毒，選擇紋狀體部，坐標為：前囟前1.0 mm，中線右旁開2.5 mm，硬膜下4.6 mm。用微量注射器將LPS 5μL［7］緩慢注射至右側紋狀體，給藥速度為1μL·min－1，對照組紋狀體注射5μL PBS。手術毀損后第2周開始進行阿樸嗎啡（0.5 mg·kg－1）誘導的行為學檢測。大鼠置于旋轉行為測試儀內，記錄大鼠30 min內的旋轉圈數。每分鐘向健側（左側）旋轉圈數平均＞7圈大鼠為成功的PD模型大鼠。

1.6 動物分組及給藥 在體實驗部分將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、紅景天苷治療組、BMSCs治療組、紅景天苷和BMSCs聯合治療組，每組12只。均在造模后2周開始給藥，假手術組不給藥；模型組每日經尾靜脈給予5 mg·kg－1生理鹽水1次；紅景天苷治療組每日經尾靜脈給藥1次（5 mg·kg－1）［8］，連續給予15 d；BMSCs治療組以1×106m L－1BMSCs移植紋狀體內，注射體積為10μL，留針10 min，緩慢退針，常規消毒并縫合傷口，每隔7 d移植1次，共移植2次。紅景天苷和BMSCs聯合治療組大鼠給予紅景天苷治療組和BMSCs治療組聯合的給藥方式。

1.7 RT－PCR 檢測 TH 根據文獻［9－10］合成引物序列。TH引物序列：上游，5′－GGACGGCGACAGAGTCTCAT－3′；下游，5′－AGCTTCCGACGCTGGCGATA－3′（512 bp）；β－actin：上游，5′－TGTCCCTGTATGCCTCTGGT－3′； 下 游， 5′－TTGATGTCACGCACGATTTC－3′（217 bp）。大鼠麻醉后，斷頭取腦，分離中腦腹側包括黑質區和腹側被蓋區，取約100 mg腦組織，剪碎，提取總RNA，以1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定mRNA的完整性。逆轉錄反應條件：42℃逆轉錄反應1 h，75℃、10 min滅活禽類成髓細胞瘤病毒（AMV）。使用晶芯熒光定量PCR系列通用試劑盒及晶芯RT－Cycler實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。以β－actin作為內參照，采用2－Δ（ΔCt）法計算產物相對量。

1.8 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析。各組大鼠旋轉次數以±s表示，兩樣本均數組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 BMSCs的形態學變化 原代培養BMSCs接種72 h后細胞開始貼壁生長，倒置顯微鏡下可見細胞有偽足伸出，呈集落式生長，7 d左右可見細胞有80%～90% 融合，行傳代處理。取第3代BMSCs檢測細胞表面抗原，本研究分離提取的BMSCs為表達干細胞標志物CD29和CD44的細胞。見圖1（插頁一）。

2.2 紅景天苷作用不同時間BMSCs數量 當紅景天苷作用BMSCs后，BMSCs增殖較對照組更為旺盛且平臺期較對照組延長。見圖2。

圖2 紅景天苷作用不同時間BMSCs數量Fig.2 Number of BMSCs after treated with salidroside for different time

2.3 各組大鼠旋轉次數 旋轉行為是檢測模型動物行為學異常的代表性實驗，旋轉次數多寡表示病情的輕重。BMSCs治療組、紅景天苷治療組、紅景天苷和BMSCs聯合治療組模型大鼠旋轉次數隨時間增加有不同程度減少，以上3組與模型組比較，旋轉次數減少程度差異有統計學意義（P＜0.05）。與BMSCs治療組和紅景天苷治療組大鼠比較，紅景天苷和BMSCs聯合治療組大鼠的旋轉次數減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 紅景天苷作用不同時間各組大鼠的旋轉次數Tab.1 Rotation number of rats in various groups after treated with salidroside for different time（n＝10±s）

表1 紅景天苷作用不同時間各組大鼠的旋轉次數Tab.1 Rotation number of rats in various groups after treated with salidroside for different time（n＝10±s）

＊P＜0.05 vs PD model group；△P＜0.05 vs BMSCs group；＃P＜0.05 vs salidroside group.

Group Rotation number Before treatment 2 weeks after treatment 4 weeks after treatment 6 weeks after treatment Sham operation 0 0 0 0 PD model 16.70±4.65 17.73±2.43 17.63±1.96 17.25±3.21 BMSCs treatment 16.36±3.15 11.53±2.01＊ 10.22±2.34＊ 7.17±2.57＊Salidroside treatment 16.13±2.42 13.11±2.37＊ 12.72±2.14＊ 9.48±2.85＊Salidroside＋BMSCs treatment 16.11±3.22 9.53±1.23＊△＃ 6.19±2.38＊△＃ 4.98±2.17＊△＃

2.4 各組大鼠TH mRNA表達水平 各組大鼠在造模后第6周收集組織提取總RNA，采用即時RT－PCR方法檢測腦組織內TH m RNA表達水平，各組大鼠TH mRNA水平各有不同，紅景天苷聯合BMSCs治療組大鼠TH m RNA的轉錄水平較高，基因變化倍數為2.2。單純BMSCs治療組基因變化倍數相對PD組為1.8倍，單純紅景天苷組基因變化倍數相對PD組為1.5倍。

3 討 論

BMSCs是存在于骨髓間質中具有多向分化潛能、類似于胚胎干細胞的一種多能干細胞［11］。大量研究［12－13］顯示：BMSCs移植對多系統疾病均有療效，同時也是組織工程研究理想的種子細胞。實驗中采用貼壁法分離、提取BMSCs，培養3 d后鏡下可見細胞貼壁，呈梭形、單核、折光率好且形成集落。傳代后細胞生長活躍，利用反復傳代法對細胞進行純化。傳至第3代檢測BMSCs表面標志物，結果顯示CD29和CD44均有較高的表達率。

在本研究中，取第3代細胞與10 mg·L－1紅景天苷共培養，對照組不加紅景天苷。通過生長曲線的繪制探討紅景天苷對BMSCs增殖、分化的影響。體外實驗生長曲線顯示：在潛伏期由于細胞對傳代操作所致損傷的恢復及新環境的適應2組細胞未見差別；進入對數生長期后，紅景天苷作用BMSCs組細胞增殖明顯活躍；進入平臺期后，對照組細胞衰退較實驗組快，提示紅景天苷對BMSCs增殖、分化有促進作用，且能延緩細胞衰老。

本研究在體實驗中紅景天苷與BMSCs聯合應用治療PD結果顯示：紅景天苷和BMSCs聯合治療組大鼠旋轉次數較PD模型組明顯減少，較BMSCs移植治療組和紅景天苷治療組大鼠的旋轉次數亦有不同程度減少，提示紅景天苷與BMSCs聯合應用治療PD較單獨使用效果更理想，二者起到了優勢互補的作用。

TH是多巴胺合成的限速酶，在多巴胺合成的過程中起關鍵作用，并且TH也是腦內多巴胺能神經元的蛋白標志物。動物腦內TH的含量不足可導致PD的一系列臨床癥狀。本研究中RT－PCR檢測結果顯示：各組大鼠TH mRNA轉錄水平各有不同，紅景天苷聯合BMSCs作用PD模型大鼠后，腦內TH mRNA的轉錄水平高于PD組；單純應用BMSCs組和單純應用紅景天苷組腦內TH mRNA的轉錄水平也較PD組有不同程度的增加，但是低于聯合應用組腦內TH mRNA轉錄水平。

綜上所述，本研究成功分離、提取了BMSCs，通過反復傳代方法對細胞進行純化。采用紅景天苷與BMSCs共培養，紅景天苷可促進BMSCs增殖、分化、延續細胞衰老，同時又不影響BMSCs生物學特性；將紅景天苷與BMSCs聯合應用治療PD模型大鼠在TH基因轉錄水平和行為學異常改善方面均優于單獨應用。

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Treatment effect of salidroside combined with bone marrow mesenchymal stem cells on rats with Parkinson’s disease

FAN Dong－yan1，WANG Ping2，CHEN Yu－bing3
（1.Department of Preventive Medicine，Medical School，Tibet University，Lhasa 850000，China；2.Department of Otorhinolaryngology and Head－Neck Surgery，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Depatment of Nuclear Medicine，Second Hospital，J ilin University，Changchun 130041，China）

Objective To study the treatment effect of salidroside combined with bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on rats with Parkinson’s disease（PD），and to provide experiment basis for curring Parkinson’s disease.Methods The BMSCs were cultured adherently，the cell surface molecules were detected by immunofluorescence.The effect of 10 mg·L－1salidroside on the proliferation and differentiation of BMSCs was detected by MTT.60 Wistar rats were randomly divided into sham group，model group，salidroside treatment group，BMSCs treatment group，and salidroside and BMSCs combination therapy group.The behavior changes were detected at a specific time and the levels of tyrosin hydroxylase（TH）mRNA in brain tissue were detected.Results The setm cell markers CD29 and CD44 were expressed successfully.Compared with control group，the proliferation of BMSCs got bigger and the plateau got longer after treated with salidroside.The rotation number of PD model rats was the least compared with the other groups（P＜0.05）.The expression level of TH mRNA was decreased.The behavior abnormalities of PD model rats were improved and the level of TH mRNA was increased after treated with salidroside and BMSCs compared with the other groups（P＜0.05）.Conclusion The treatment efficacy of salidroside combined with BMSCs on PD rats is better than salidroside or BMSCs alone.

salidroside；bone mesenchymal stem cells；Parkinson’s disease

R745

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1073－04

2012－05－23

國家自然科學基金資助課題（81160360）；西藏大學科研啟動經費資助課題（2010－2013）

范東艷（1973－），女，吉林省吉林市人，講師，醫學博士，主要從事干細胞應用研究。

陳玉丙（Tel：0431－88796179，E－mail：yb0707＠163.com）