陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53的分離及鑒定

王 丹，史紅艷，余靜丹，周佳琦，李菁華，孫延波

（吉林大學白求恩醫學院病原生物學系，吉林 長春130021）

陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53的分離及鑒定

王 丹，史紅艷，余靜丹，周佳琦，李菁華，孫延波

（吉林大學白求恩醫學院病原生物學系，吉林 長春130021）

目的：以14株陰溝腸桿菌為宿主菌，從環境污水中分離噬菌體，分析其生物學特性，鑒定其分型。方法：采用雙層瓊脂噬斑法分離并鑒定噬菌體。純化后的噬菌體經負染法染色，通過電鏡觀察其大小和形態；提取噬菌體基因組，進行酶切電泳分析；通過裂解譜的分析，確認噬菌體的特異性和裂解宿主菌范圍。結果：成功分離1株裂解性噬菌體，電鏡顯示噬菌體的頭部呈球形，直徑約60 nm，尾部長約130 nm。瓊脂糖凝膠電泳顯示其基因組約40000 bp，且含多種酶切位點。特異性實驗顯示其呈現較窄的宿主范圍。結論：分離的陰溝腸桿菌噬菌體（命名為ФEc53）屬于有尾病毒目，管尾病毒科，是一種特異性高、裂解性強的毒性噬菌體。

噬菌體；陰溝腸桿菌；細菌耐藥

陰溝腸桿菌屬腸桿菌科細菌，為革蘭氏陰性桿菌，具有鞭毛，能利用檸檬酸鹽作為碳源，可發酵葡萄糖，產酸產氣。陰溝腸桿菌廣泛分布于自然界，亦可存在于人和動物的腸道中。陰溝腸桿菌是醫院內感染常見的致病菌之一［1］，可引起呼吸道感染、尿道感染、敗血癥和腹膜炎等。國內細菌耐藥性監測數據［2］顯示：陰溝腸桿菌對β－內酰胺酶類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素均表現了較高的耐藥率，這為陰溝腸桿菌感染的抗生素療法造成一定的困難。噬菌體是侵襲細菌的病毒，存在于自然界的環境中，利用其對細菌裂解的特異性和高效性，噬菌體除可用于細菌的分型鑒定外，在多重耐藥菌株的治療、食品加工衛生和生態環境的凈化等領域有著廣闊的應用前景［3］。雖然噬菌體的研究開展已久，但國內外尚未見有關陰溝腸桿菌噬菌體的深入研究。本實驗通過雙層瓊脂噬斑法從環境中分離1株針對陰溝腸桿菌的裂解性噬菌體，并對其生物學特性進行初步的分析及鑒定，為進一步研究陰溝腸桿菌噬菌體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑與儀器 14株陰溝腸桿菌來自長春中醫藥大學附屬醫院檢驗科，菌株經法國生物梅里埃公司VITEK－32全自動微生物分析鑒定系統鑒定。營養瓊脂（青島高科園海博生物技術有限公司），胰蛋白胨和酵母浸粉（北京奧博星生物技術有限責任公司），Agar瓊脂粉（Bacteriological Grade公司），脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ）、Tris－飽 和 酚（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A）（Sigma公司），氯仿（天津天泰精細化學品有限公司），PEG 8000（天佳生物技術有限公司），蛋白酶 K（Bacteriological Grade公司），Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ（Takara公司）。

1.216 S r RNA陰溝腸桿菌PCR引物的設計與合成 根據GenBank查詢陰溝腸桿菌16 S r RNA基因序列（Accession：NC＿04121），并設計引物，通過多聚酶鏈反應，進一步確認陰溝腸桿菌。設計序列如下：上游引物，5′－TCCACAGAACTTTCCAGAGATG－3′； 下 游 引 物，5′－CCTACGGTTACCTTGTTACGACTT－3′。擴增目的基因片段的長度為519 bp，PCR反應條件：95℃、5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min，共35個循環；72℃、10 min。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.3 噬菌體的分離和純化 取500 m L污水，加入固體CaCl2至終濃度1 mmol·L－1，5000 r·min－1離心10 min，取上清255 m L置于1000 m L三角燒瓶中，加50 m L Luria－Bertani（LB）培養基和14株陰溝腸桿菌菌液各1 m L，37℃振蕩過夜培養。10000 r·min－1離心 5 min，取上清用0.22μm濾膜濾過除菌。分別以14株陰溝腸桿菌為宿主菌，與濾過液混合靜止15 min，加入融化的0.7%LB瓊脂（50℃）并均勻地鋪在固體營養瓊脂平板上，37℃培養16～18 h，觀察噬菌斑的形成情況。噬菌斑形成時，挑取單個噬菌斑接種至對應的宿主菌進行擴增，單個噬菌斑經3～5次反復純化后可得到較純化的噬菌體。

1.4 噬菌體的電鏡觀察 取純化的噬菌體懸液20μL滴于銅網上，待其自然沉淀15 min，用濾紙從側面吸干多余的液體，加1滴2%磷鎢酸到銅網上，染色10 min，干燥后進行電鏡觀察。

1.5 噬菌體核酸提取和酶切圖譜 參照文獻［4］的方法，在噬菌體懸液中加入DNaseⅠ至終濃度5 mg·L－1，RNase A至1 mg·L－1，37℃溫育1 h。加入EDTA（p H 8.0）至終濃度20 mmol·L－1，加蛋白酶K至終濃度50 mg·L－1，加十二烷基硫酸鈉（SDS）至終濃度0.5%，56℃溫育1 h。用等體積平衡酚（p H 8.0）抽提離心，收集水相，再用等體積氯仿抽提1次，收集水相。加入體積比為1∶10醋酸鈉 NaAc（3 mol·L－1，p H 5.2），于2倍體積的無水乙醇沉淀核酸，干燥后用100μL雙蒸水溶解核酸，－20℃保存。提取的噬菌體核酸用限制性內切酶Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ進行酶切電泳分析。

1.6 宿主菌的特異性判定和裂解譜實驗 分別將大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和14株陰溝腸桿菌（編號分別為03、04、05、06、7、8、53、87、89、136、146、213、1121和1155）接種至LB液體培養基，37℃振蕩培養，當A590值為0.2時，將細菌培養液置于冰箱（4℃）2 h后，分別加入純化的噬菌體100μL，繼續培養20 min，測其A590值。該方法重復3次。計算加入噬菌體前后的A590值差值的平均值，判定噬菌體對細菌的特異性和裂解譜的范圍。

2 結 果

2.1 菌株的鑒定 PCR擴增陰溝腸桿菌16S r RNA基因部分序列，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見500 bp左右大小的特異性條帶，與預期值相符（目的片段為519 bp），而質控菌株大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的PCR產物則為陰性。見圖1。

2.2 噬菌體的噬菌斑的形態 采用雙層瓊脂法分離出1株陰溝腸桿菌噬菌體，命名為ФEc53。噬菌體在雙層瓊脂平板上形成圓形、透明，噬菌斑直徑為2～4 mm。單個噬菌斑經3～5次反復純化后，測得噬菌體滴度為2.5×1010PFU·mL－1。見圖2。

圖1 陰溝腸桿菌16S rRNA PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplification of 16S r RNA of Enterobacter cloacae

圖2 陰溝腸桿菌噬菌體噬菌斑Fig.2 The plaques of Enterobacter cloacae bacteriophages

2.3 電鏡觀察噬菌體的形態 純化后的噬菌體經負染后，電鏡下噬菌體的頭部呈球形，直徑約60 nm，有一長尾約130 nm，根據噬菌體新的分類法，噬菌體ФEc53屬于有尾病毒目、管尾病毒科。見圖3。

圖3 陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53電鏡圖像Fig.3 Electron micrograph of Enterobacter cloacae bacteriophageФEc53

2.4 噬菌體基因組的酶切鑒定 噬菌體ФEc53基因組經3種限制性內切酶酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，噬菌體ФEc53基因組含Eco RⅠ、Eco RⅤ和NdeⅠ的多個酶切位點，根據Quantity One軟件的比對和分析，噬菌體ФEc53基因組大小約為40000 bp。見圖4。

圖4 噬菌體ФEc53基因組的酶切電泳圖Fig.4 Electrophoregram of enzyme digestion of genome profiles of Enterobacter cloacae bacteriophageФEc53

2.5 宿主菌的特異性和裂解范圍 為進一步確認噬菌體的特異性和裂解譜的范圍，觀察不同宿主菌（14株陰溝腸桿菌、大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853）在與噬菌體作用前后的含量變化。在所試菌株中只有1株陰溝腸桿菌（編號為53）對所分離的噬菌體敏感，其他細菌在與噬菌體作用后繼續生長（細菌的含量增加）。見表1。

3 討 論

陰溝腸桿菌是醫院內感染常見的條件致病菌之一，特別是在免疫缺陷和器官移植的患者中，陰溝腸桿菌可引起呼吸道感染、尿路感染、腹膜炎和敗血癥等疾病。2010年度衛生部全國細菌耐藥報告［5］顯示：陰溝腸桿菌在臨床分離的腸桿菌科細菌中已上升至第3位，此外，由于抗生素的長期和不合理應用所造成的選擇性壓力增高，陰溝腸桿菌對β－內酰胺類抗生素出現了較高的耐藥率［6］，并且通過耐藥性變異形成新型耐藥機制［7－8］，這是臨床抗感染面臨的難題。噬菌體是能夠特異感染細菌的病毒，廣泛分布于自然界，分離純化和制備噬菌體用以預防和治療細菌性感染的研究倍受關注。

表1 宿主菌的特異性和裂解范圍Tab.1 The specificity and cracking range of host baterium

本研究采用雙層瓊脂噬斑法從環境的污水中分離出1株陰溝腸桿菌噬菌體（ФEc53），在雙層瓊脂平板上可形成清晰的噬菌斑。有關陰溝腸桿菌噬菌體的研究國內至今尚未見報道，本次分離的陰溝腸桿菌噬菌體ФEc53，有一長尾（約130 nm），無收縮尾鞘，頭部呈球形（多面體立體對稱），直徑約60 nm，無囊膜。根據國際病毒分類委員會分類標準［9］，該噬菌體屬于有尾病毒目，管尾病毒科。目前所分離到的噬菌體絕大多數屬有尾病毒目［10］，分屬3個科，即肌尾病毒科、管尾病毒科和短尾病毒科。現已知管尾病毒科的特征是尾部較長（64～570 nm），無收縮尾鞘，頭部為正多面體，雙鏈DNA。本研究采用Quantity One軟件比對和初步分析顯示：噬菌體ФEc53基因組約為40000 bp；限制性內切酶分析表明：Eco RⅠ的酶切位點有9個，Eco RⅤ有15個酶切位點，NdeⅠ則有7個酶切位點。而在GenBank登錄（HQ 641380.1）的陰溝腸桿菌噬菌體的基因組大約59000 bp，Eco RⅠ的酶切位點有15個，Eco RⅤ的酶切位點有37個，NdeⅠ有27個位點。因此，此次分離的陰溝腸桿菌噬菌體與已在GenBank登錄的噬菌體有明顯的不同。

宿主菌裂解譜的研究證明：噬菌體ФEc53僅能裂解1株陰溝腸桿菌，對其他分離并鑒定的陰溝腸桿菌不敏感，說明噬菌體ФEc53對其他來源的陰溝腸桿菌無特異性，同時也反映出不同菌株的陰溝腸桿菌其表面的受體無法被噬菌體ФEc53所識別，進而不能感染和裂解不同來源的同種宿主菌。這種嚴格的特異性在噬菌體抗細菌感染的實際操作中受到一定的限制。為克服這一不足，通常采用所謂的噬菌體的 “雞尾酒”療法［11］，即將含有多株噬菌體的制劑用來治療和預防某種細菌的感染。因此，在進一步的研究中，一方面應分離和篩選裂解譜寬的噬菌體，另一方面應分離多株陰溝腸桿菌噬菌體組成 “雞尾酒”制劑，以探討針對陰溝腸桿菌特別是耐藥性陰溝腸桿菌的感染的治療和預防。

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Isolation and identification of Enterobacter cloacae bacteriophagesФEc53

WANG Dan，SHI Hong－yan，YU Jing－dan，ZHOU Jia－qi，LI Jing－hua，SUN Yan－bo
（Department of Pathogenobiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To isolate bacteriophages from raw sewage and to investigate the biological properties of bacteriophages using 14 strains of Enterobacter cloacae as host cells，and to identify its structure.Methods Bacteriophages were isolated from sewage with double－agar and identified by plaque method.After purification and negative－staining of bacteriophages，the morphologic features of bacteriophages were examined by electron microscope，the bacteriophage genome was extracted for electrophoresis；the lytic spectrum of host was carried out for specificity and cracking range of the Enterobacter cloacae.Results BacteriophageФEc53 was isolated and identified，electron micrograph showed that the head of bacteriophage was spherical，60 nm in diameter and it had a tail，about 130 nm long.Electrophoresis of phage DNA revealed that the size of genome was about 40000 bp and contained lots of restriction sites.The lytic spectrum trial showed it had a relatively narrow host range.Conclusion The isolated Enterobacter cloacae（namedФEc53）bacteriophage belongs to Caudovirales，Siphoviridae.According to its biologic features，bacteriophageФEc53 has strong lytic and high specificity.

bacteriophages；Enterobacter cloacae；drug－resistant bacteria

R378.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1077－04

2012－06－21

國家自然科學基金委主任基金資助課題（81150037）

王 丹（1987－），女，吉林省長春市人，在讀醫學碩士，主要從事噬菌體分子遺傳學研究。

李菁華（Tel：0431－85619574，E－mail：ljh＠jlu.edu.cn）；孫延波（Tel：0431－85619574，E－mail：sunyb＠jlu.edu.cn）