小鼠成纖維細胞飼養層的制備及C57BL／6小鼠胚胎干細胞系的建立

張小梅，方廖瓊，王智彪

（重慶醫科大學生物醫學工程學院 省部共建超聲醫學工程國家重點實驗室超聲醫學工程重慶市市級重點實驗室，重慶400016）

小鼠成纖維細胞飼養層的制備及C57BL／6小鼠胚胎干細胞系的建立

張小梅，方廖瓊，王智彪

（重慶醫科大學生物醫學工程學院 省部共建超聲醫學工程國家重點實驗室超聲醫學工程重慶市市級重點實驗室，重慶400016）

目的：制備小鼠成纖維細胞飼養層并建立C57BL／6小鼠胚胎干細胞（ESC）系，為進一步建立人ESC系提供依據。方法：取妊娠12.5～14.5 d的胎鼠，組織消化法分離培養小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）；收集C57BL／6小鼠3.5 d的囊胚培養于小鼠制作的飼養層上；分離內細胞團（ICM），擴增傳代40代以上。觀察ESC集落的生長情況。采用堿性磷酸酶（AKP）染色、免疫組織化學早期胚胎特異性表面抗原（SSEA－1）、八聚體結合轉錄因子4（OCT－4）染色和體內分化實驗對ESC集落進行鑒定。結果：分離培養后得到的ESC可穩定傳代至40代以上，且均呈集落樣生長。經AKP、SSEA－1和OCT－4染色后ESC均呈紅褐色陽性表達，接種于裸鼠均可形成畸胎瘤；HE染色，有3個胚層組織成分。結論：成功建立了C57BL／6小鼠ESC系。

胚胎成纖維細胞；C57BL／6小鼠；胚胎干細胞；堿性磷酸酶

胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）是從早期胚胎內細胞團和原始生殖細胞中分離出來的全能干細胞，具有無限增殖和全能分化的潛力。由于小鼠ESC具有胚胎嵌合和生殖系嵌合能力［1］以及在特定條件下可定向分化［2－3］等的特性，因此近年來ESC在早期胚胎發育研究［4］、基因打靶技術的改進［5］和利用細胞移植進行疾病的治療［6］等研究領域得到了廣泛的應用。ESC已成為生物醫學領域的研究熱點之一。ESC的建系是一項基礎性的工作，不同品系小鼠ESC的建系效率有很大的差異，建系途徑和方法各有特點，一個品系ESC的建系方法不一定都適合于其他品系，而ESC研究的基礎與核心是有效地分離并建立穩定的ESC系。本研究嘗試用自制的小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）作為飼養層細胞，分離培養C57BL／6小鼠ESC，最終建立穩定C57BL／6小鼠ESC系，為進一步的研究提供實驗基礎，為建立人ESC系提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器 健康、成年C57BL／6小鼠，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，8～10周齡，體質量20～25 g，25℃環境下飼養，光照周期12 h，自由攝水、飲食，挑選發情期雌性小鼠按1∶1比例進行雌、雄鼠合籠過夜，次晨發現陰栓者為孕第l天。H－DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）；胎 牛 血 清（FBS）（Gibco公司）；絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）（Roche公司）；C57BL／6小鼠胚胎干細胞完全培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；BCIP／NBT堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，AKP）顯色試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Anti－SSEA－1、Anti－OCT－4抗體（Millopre公司）；兔SPKit一抗為兔來源的免疫組化試劑盒（sp－0023）、鼠SPKit一抗為鼠來源的免疫組化試劑盒（sp－0024）（北京博奧森生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。TC 2323 型 二 氧 化 碳 孵 箱（Shel－Lab）；LX70型倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 小鼠MEF的分離培養 取12.5～14.5 d的妊娠小鼠，斷頸處死。無菌條件下取出小鼠子宮，分離胎鼠，PBS充分洗滌；去除胎鼠的頭、尾、四肢和內臟，PBS液洗凈，用滅菌的眼科剪將剩余組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，向組織塊加入適量0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA消化液，輕輕吹打數次，室溫或37℃消化3～5 min，加等體積含血清培養基終止消化，靜置3～5 min后收集上層懸液；重復上步操作2～5遍，組織基本可以消化完全；收集的細胞懸液800～1000 r·min－1離 心 5 min，培 養 液（HDMEM＋10%FBS）重懸細胞至培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養；培養第2天初次換液，以后視細胞情況隔天換液，細胞匯合度達80%以上后，按1∶3～1∶5傳代。

1.3 MEF飼養層細胞的制備 采用純化的P2～4代MEF細胞制備飼養層，顯微鏡下觀察細胞生長融合80%時，用10 g·L－1的 MMC處理3 h，以每孔2×105的密度接種到0.1%明膠包被過的六孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，24 h后可作飼養層細胞使用，用前去除原培養基，PBS洗1～2次后更換成小鼠ESC完全培養基即可供ESC培養。

1.4 ESC的分離培養與傳代 無菌取出妊娠3.5 d小鼠子宮，4號針頭沖胚，解剖顯微鏡下收集發育良好的囊胚，置于飼養層上培養，48～72 h后透明帶自行脫落，內細胞群（inner cell mass，ICM）孵出并長大。4～5 d后用自制的毛細針挑取ICM，使之與飼養層和滋養層細胞分離，并吸至消化液小滴內（0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA混合消化液），使ICM在消化液小滴內作用3～5 min，并用自制的玻璃微針輕輕吹吸ICM數次，使之分散成若干個由細胞組成的小團塊，這時可繼續將ICM消化成單細胞，再接種于新的飼養層鋪板的6孔板中。3～5 d后挑取單個干細胞集落微滴消化離散，接種于新的飼養層上，傳代至3代左右，一般3～5 d即可傳代，直接加入適量0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA混合消化液消化ESC，37℃或者室溫作用2～4 min，收集細胞后接種于新的飼養層上。

1.5 ESC細胞形態學鑒定 在倒置顯微鏡下觀察囊胚、ICM和ES集落的形態，觀察其生長特征。

1.6 AKP染色觀察ESC ESC傳代培養后48～72 h，棄去原培養液，用PBS洗凈，加入適量4%多聚甲醛溶液固定2～5 min，染色過程按照BCIP／NBT AKP顯色試劑盒的說明操作，普通光學顯微鏡觀察細胞被染成深藍色至藍紫色為陽性細胞，蘇木精復染10 min后，水洗，涼干，光鏡下觀察、拍照，細胞被染成紅褐色為AKP表達陽性細胞。

1.7 免疫組織化學染色檢測ESC中階段特異性胚胎 抗 原 1（stage specific embrynic antigen 1，SSEA－1）和 八聚 體 結 合 轉 錄 因 子4（octamerbinding transcription factor－4，OCT－4）表達 將飼養層細胞制備于10 mm×10 mm載玻片上，24 h后換ESC完全培養基，并將ESC按照1∶5傳代培養于該飼養層上，培養48～72 h后，棄去原培養液，用PBS洗凈，加入適量4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS清洗標本3次，每次2 min；0.5%Triton X－100 孵 育 20 min；PBS 清 洗 標 本3次，每次2 min；3%H2O2去離子水孵育10～15 min，以消除內源性過氧化物酶活性；分別滴加SP－0023、SP－0024試劑盒中試劑A室溫孵育10～15 min，傾去，勿洗；分別加入1∶100稀釋后的一抗SSEA－1 Moues Ig M和1∶1000稀釋后的一抗OCT－4 Rabbit IgG，4℃過夜；后續步驟分別按照SP－0023、SP－0024試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書進行操作，染色后普通光學顯微鏡觀察、拍照，細胞被染成紅褐色為SSEA－1和OCT－4表達陽性細胞。1.8 ESC在小鼠體內分化能力的鑒定 ESC傳代后48～72 h，消化離心收集細胞后，用少量PBS重懸計數，在裸鼠左下肢腹股溝處皮下注射點接種約5×105個ESC，飼養6～8周，取生成的腫塊切片，常規HE染色，觀察ESC在體內的生長、分化情況。

2 結 果

2.1 MEF形態學變化 MEF細胞為貼壁型生長細胞，大小不均。顯微鏡下觀察，細胞成梭形、多邊形或條帶狀，胞質透明，細胞質中央為卵圓形核，周邊向外伸出纖維狀偽足，細胞生長較快，隨著細胞的增殖逐漸連接成片。原代MEF細胞形態多樣（圖1A），有其他細胞混雜，傳代過程中雜細胞逐漸被去除。2～5代的細胞純度狀態均較好（圖1B、C），分裂增殖較快，生長旺盛。第6代以后細胞生長緩慢，形態變異，體積增大，立體感明顯變差，且細胞內出現明顯粗顆粒區，細胞之間空隙較大，呈衰老征象（圖1D）。因此選擇第2～5代MEF作為飼養層細胞較好。

圖1 光鏡下不同代數MEF細胞形態學（×100）Fig.1 The morphology of MEF cells at different generations under light microscope（×100）

2.2 飼養層細胞的制備情況 光學顯微鏡下觀察，經MMC處理后，MEF細胞貼壁較慢，失去分裂增殖能力，制備的MEF飼養層生長狀態良好，處理前后細胞形態基本無異。見圖2。

2.3 囊胚、ICM及ESC的生長狀態 囊胚培養24～48 h開始脫帶貼壁，培養3～5 d，內細胞團迅速增殖凸起，呈現卵圓柱狀或鳥巢狀，此時可以分離內細胞團。ESC有其典型的形態學特征：ESC增殖旺盛，細胞間緊密，呈典型的 “鳥巢狀”生長，邊緣清晰，表面光滑，結構致密，與飼養層細胞間界限清晰；第1、2代時細胞集落形成稍慢，以后一般生長4 d或5 d即可傳代，傳到第40代內細胞集落形態規則，細胞間緊密，邊緣分化細胞極少或未見分化細胞。見圖3（插頁一）。

圖2 光鏡下MMC處理前后MEF細胞形態學（×100）Fig.2 The morphology of MEF cells before and after treated with MMC under light microscope（×100）

2.4 ESC的AKP染色結果 AKP染色，未分化的P2～40代ESC經染色后成紅褐色，飼養層未著色，ESC邊緣規則，與飼養層界限清楚。見圖4（插頁一）。

2.5 ESC的SSEA－1和OCT－4免疫組織化學染色結果 免疫組織化學染色，未分化的P2～40代ESC的SSEA－1和OCT－4染色后均呈紅褐色，即陽性表達，而飼養層未著色，ESC邊緣規則，與飼養層界限清楚。見圖5和6（插頁一）。

2.6 體內分化能力鑒定 ESC接種在裸鼠左下肢腹股溝后約2周左右開始出現明顯可見的包塊長出；培養6～8周后，包塊平均約有2.5 cm×1.5 cm×1.2 cm大小，取生成的腫塊切片，行常規HE染色，觀其組織成分包含外、中和內3個胚層的多種組織成分。見圖7（插頁二）。

3 討 論

自1981年Evans等［7］首次成功地從著床前小鼠胚胎ICM成功分離并建立小鼠ESC系以來，人們已經成功地從ESC誘導出不同胚層的細胞和器官組織，ESC還可以與受體胚胎嵌合，形成嵌合體，并可在體外進行各種基因操作。目前，ESC已經成為研究哺乳動物早期胚胎發生、細胞組織分化和基因表達調控等的理想模型，并可為未來臨床細胞替代療法和組織器官移植等提供無盡的供體來源。

體外維持ESC未分化狀態的增殖培養是研究ESC生物學特點和應用ESC的前提基礎。ESC培養主要采用飼養層細胞，已形成一種常規且穩定的ESC培養方式。目前，用于制備飼養層的細胞有原代MEF及已成系的MEF系STO細胞。其中原代MEF取材容易，價格低廉，在ESC建系、擴增培養中最為常用。本研究參照目前較規范的原代MEF分離培養方法，在實驗室分離培養獲得原代MEF，并制備了飼養層細胞，能夠很好地支持ESC生長，分離的小鼠ESC集落增殖呈典型的鳥巢狀，其細胞圓小，細胞核大，排列緊密，邊緣清晰，細胞之間界限不清楚，符合小鼠ESC的一般特性。

AKP相對分子質量為56000，屬于同源二聚體蛋白。每個單體由449個氨基酸組成，完整的AKP分子呈現典型的α／β的拓撲結構，同時每個單體均具有1個活性中心。AKP的高表達，與未分化的多能干細胞相關，因此AKP染色可作為檢測未分化狀態ESC的一個重要的標志［8－9］。未分化ESC中會表達豐富的AKP，己分化的干細胞中表達減少或消失，而且往往該酶活性越高的ESC才具有更廣泛的分化能力［10］。ESC具有表達早期胚胎細胞、胚胎生殖細胞（embryonic germ cell，EGC）表面抗原的特性。早期胚胎階段特異性抗原SSEA－1、3、4是球形的糖脂，能被單克隆抗體所識別檢測到。因為存在種屬差異，小鼠ESC只表達早期胚胎細胞的特異性表面抗原SSEA－1，而不表達 SSEA－3和 SSEA－4［11］，表現出 SSEA－1陽性。常用單克隆抗體SSEA－1檢測ES細胞表面抗原作為發育全能性的一種標志。本研究中對傳至第P2～40代的細胞集落進行AKP染色及SSEA－1免疫組織化學染色，結果均呈強陽性，這說明分離培養出的ESC集落保持著未分化狀態及發育全能性，持續傳代培養后其ESC特性仍保存，說明培養的ESC較穩定。

OCT－4是POU轉錄因子家族中的一員，是由POU5F1基因編碼。高水平的OCT－4的表達被認為與 ESC全能性有關［12－13］。小鼠的 OCT－4是一種有352個氨基酸序列的蛋白質，且在小鼠中OCT－4只限定在多潛能細胞中表達［14］。Guo等［15］的研究結果表明：受精卵所表達的OCT－4對建立ESC系是必需的，目前OCT－4也同樣廣泛地用于鑒定ESC是否處于未分化狀態。本實驗采用免疫組織化學方法對傳至第P0～35代的細胞集落OCT－4表達產物的檢測結果表明：培養的ESC的OCT－4產物陽性，進一步證明分離培養的ESC處于未分化的多潛能狀態。

ESC發育多能性是指ESC可以分化成各種體細胞，包括生殖細胞。本實驗體內分化研究過程中所獲得的畸胎瘤中存在多種組織細胞，如一些管狀結構、神經樣組織和肌肉組織，進一步證明所分離獲得的小鼠ESC具有分化發育成源于3個胚層的組織細胞類型的能力。

本研究通過提取原代MEF制備飼養層，利用體內發育的早期胚胎分離獲得的ESC體內外均具有分化的多能性且具備小鼠ESC典型特征，因此建立了穩定的小鼠ESC系，可為進一步建立人ESC系提供理論依據和實驗基礎。小鼠ESC的成功分離培養為本實驗室進一步進行ES組織工程研究和人ESC系的建立等工作奠定基礎。

［1］Sukoyan MA，Kerkis AY，Melo MR，et al.Establishment of new murine embryonic stem cell lines for the generation of mouse models of human genetic diseases［J］.Braz J Med Biol Res，2002，35（5）：535－542.

［2］Nakayama T， Momoki－Soga T. Astrocyte－derived factors instruct differentiation of embryonic stem cells into neurons［J］.Neurosci Res，2003，46（2）：241－249.

［3］Tian HB，Bai ZL，Wang H，et al.Efficient differentiation of embryonic stem cells into neurons in glial cell－conditioned medium under attaching conditions［J］. Acta Biochim Biophys Sin，2005，37（7）：480－487.

［4］Weitzer G.Embryonic stem cell－derived embryoid bodies：aninvitromodel of eutherian pregastrulation development and early gastrulation ［J］. Handb Exp Pharmacol，2006（174）：21－51.

［5］王 宏，沈子龍，奚 濤，等.條件性基因打靶技術研究進展［J］.藥物生物技術，2001，8（1）：54－57.

［6］牟靜嵐，時永全.干細胞移植與消化系統疾病治療的進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2006，22（4）：550－552.

［7］Evans MJ，Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］.Nature，1981，292（5819）：154－156.

［8］Du L，Lin G.Generation and identification of pluripotent stem cells from human embryonic fibroblast cells by 4 defined factors［J］.Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009，34（12）：1157－1165.

［9］Li C，Zhou J，Shi G，et al.Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid－derived cells［J］.Hum Mol Genet，2009，18（221）：4340－4349.

［10］Li M，Ma W，Hou Y，et al.Improved isolation and culture of embryonic stem cells from chinese miniature pig［J］.J Reprod Dev，2004，50（2）：237－244.

［11］Brenner CA，Wolny YM，Adler RR.Alternative splicing of the telomerase catalytic subunit in human oocytes and embryos［J］.Mol Reprod，2004，5（9）：845－850.

［12］李東偉，李文雍.轉錄因子Oct4、Sox2、Nanog在早期胚胎發育過程中的表達凋控［J］.生物學雜志，2007，24（3）：6－8.

［13］Niwa H，Miyazaki J，Smith AG.Quantitative expression of Oct－3／4 defines differentiation，dedifferentiation or self－renewal of ES cells［J］.Nat Genet，2000，24（4）：372－376.

［14］Pralong D，Lim ML，Vassiliev I，et al.Tetraploid embryonic stem cells contribute to the inner cell mass of mouse blastocysts［J］.Cloning Stem Cells，2005，7（4）：272－278.

［15］Guo Y，Einhorn L，Kelley M，et al.Redox regulation of the embryonic stem cell transcription factor Oct－4 by thioredoxin［J］.Stem Cells，2004，22（3）：259－264.

Preparation of mouse fibroblast feeder layers and establishment of embryonic stem cell lines of C57BL／6 mice

ZHANG Xiao－mei，FANG Liao－qiong，WANG Zhi－biao
（Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine Co－founded by Chongqing and Ministry of Science and Technology，Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Engineering in Medicine，School of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To prepare mouse fibroblast feeder layers and to establish C57BL／6 mouse embryonic stem cell（ESC）lines and to provide basis for the further establishment of human ESC lines.Methods The mouse embryonic fibroblasts（MEF）were isolated from the mouse embryos at 13.5－14.5 d by primary tissue digestion method and the 3.5 d blastulae of C57BL／6 mice were cultured on the mouse fibroblast feeder layer incubation；the inner cell mass（ICM）was separated and amplified and passaged over 40 generations.The growth of the MEF colonies was observed.The ESC colonies were identified by alkaline phosphatase（AKP）staining，early embryospecific surface antigen（SSEA－1） and octamer－blinding transcription factor 4（OCT－4） staining，and differentiation experiments in vivo.Results The ESC after isolation and culture could stably passage to more than 40 generations and showed a colony－like growth.The ESC showed a red－brown positive expression after AKP，SSEA－1 and OCT－4 staining.The teratomas formed after ESC was inoculated in nude mice.HE staining showed that there were three germ layer tissue components in ESC.Conclusion The C57BL／6 mouse ESC lines are successfully established.

embryonic fibroblast；C57BL／6 mouse；embryonic stem cell；alkaline phosphatase

Q132.8

A

2012－04－28

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目資助課題（2011CB707902）

張小梅（1986－），女，重慶市人，醫學碩士，主要從事胚胎干細胞與腫瘤相互作用關系方面的研究。

王智彪（Tel：023－68485021，E－mail：wangzhibiao＠haifu.com）

1671－587Ⅹ（2012）06－1081－05